B19病毒VP1u蛋白对胎鼠心脏的影响

目的探讨B19病毒vplu蛋白是否影响心脏发育及相关机制。方法对不同孕龄母鼠注射B19病毒vplu蛋白,采集胎鼠心脏组织标本,通过光镜、电镜、免疫组织化学、TUNEL和原位杂交技术观察心脏细胞结构变化、细胞凋亡及相关基因或表面标志物变化。结果实验期间有23只小鼠怀孕,vplu蛋白和(或)抗vplu蛋白mAh干预组与对照组均未见胎鼠流产。各组产仔数量及鼠心脏重量进行组间方差分析,差异无显著性(P>0.05)。vplu蛋白和(或)抗VPIu蛋白mAl干预组光镜下均可见心肌细胞间隙增宽,胞质透明淡染,部分心肌细胞脂肪变性。电镜下vplu蛋白(或)和vplu蛋白mAh共同注射组、抗VPIu蛋白mAb注射组均可见线粒体聚集在增宽的心肌细胞间隙中,有空泡化,并TUNEL免疫荧光和免疫组织化学显示心肌细胞发生细胞凋亡。对照组胎鼠均未见异常。结论B19病毒vplu蛋白与胎鼠流产、心脏发育畸形无关,与胎鼠心脏水肿有关。

人细小病毒B19-VP1u保守区外C端氨基酸对sPLA2活性的影响

为探寻人细小病毒B19-VP1u保守区外氨基酸序列对sPLA2活性的影响,依次截短B19-VP1u保守区外C端的氨基酸序列,表达纯化截短突变的蛋白后分别检测其sPLA2活性。结果显示,截短7个氨基酸时,酶活性没有明显变化;截短15个氨基酸时,酶活性显著降低;截短23个氨基酸时,几乎没有酶活性。表明保守区外C端的第8～24个氨基酸之间的序列对酶活性有显著影响,推测其在维持酶的正确三维结构中起重要作用。

人博卡病毒1型独特区VP1u抗体制备及应用

人博卡病毒1型(human bocavirus 1, HBoV1)是全球流行的重要呼吸道病毒,对其的研究尚处于初期阶段。本研究针对HBoV1的VP1独特区(VP1u)通过原核表达的方式进行蛋白表达,并通过纯化、免疫小鼠成功获得了蛋白的抗体血清,通过ELISA评价了抗体对相应蛋白及临床病毒阳性样品的效价,并在后者发现制备抗体在1:50稀释时A450对阴性对照有4倍升高。利用所制备的抗体成功用于HBoV1广州株(GU338055)反向遗传系统的VP1u的免疫荧光研究中。本研究成功制备了HBoV1抗原VP1u抗体并应用,为HBoV1后续深入研究提供了重要的工具,具有重要意义。

人细小病毒B19VP1u多克隆抗体的制备及其保守区外N端氨基酸对sPLA2活性影响的初步研究

【目的】制备人细小病毒B19-VP1u的多克隆抗体,探究VP1u多克隆抗体及其保守区外N端氨基酸对病毒磷脂酶A2活性的影响。【方法】首先通过分子克隆方法构建相应原核表达载体;利用原核表达系统纯化含MBP标签的VP1u全长及N端系列截短突变融合蛋白;接着免疫新西兰大白兔制备全长VP1u蛋白的多克隆抗体;最后利用磷脂酶A2活性检测试剂盒检测了纯化蛋白的磷脂酶A2活性。【结果】Western blot及免疫荧光实验证实制备的多克隆抗体具有较高的特异性;磷脂酶A2活性检测发现全长VP1u-MBP融合蛋白具有一定的活性,该活性可以被VP1u的抗体抑制;N端保守区外截短系列蛋白的酶活检测发现,N端截掉12个氨基酸时酶活降低53%,截掉67个氨基酸时酶活性几乎完全丧失。【结论】首次发现VP1u保守区外N端氨基酸,尤其是第12个氨基酸前的区域以及第22-67个氨基酸之间的区域,对sPLA2活性的保持具有重要意义,推测该区域可能对维持正常的蛋白构象起重要的作用;而其特异性多克隆抗体的制备也为进一步研究B19病毒VP1u在病毒复制周期的作用奠定基础。

人博卡病毒2型VP1U突变对sPLA2活性的影响

对HBoV2 VP1U蛋白进行原核表达并检测其sPLA_2活性,对其关键氨基酸进行突变,检测突变对sPLA_2活性的影响。构建重组质粒pMD18T-VP1U,选取VP1U蛋白4个关键氨基酸为突变点,分别进行原核表达,蛋白纯化后用sPLA_2试剂盒检测sPLA_2活性,对比突变前后VP1U蛋白sPLA_2活性有无变化。野生型HBoV2VP1U蛋白的sPLA_2活性为0.243μmol/min/mL,具有sPLA_2活性;突变体L19P、P21R、D42H及Y45N蛋白的sPLA_2活性分别为野生型蛋白的1.2%、1.2%、0.82%、0.41%。野生型HBoV2VP1U蛋白具有sPLA_2活性,突变体蛋白均几乎完全丧失了sPLA_2活性,提示19、21、42、45位4个氨基酸是维持sPLA_2活性的关键氨基酸。该研究为靶向抗病毒药物的研究提供了理论基础。

B19病毒XA株VP1独特区真核表达系统的建立及鉴定

目的:克隆B19病毒XA株VP1u基因,构建真核重组表达载体。方法:从已构建好的B19病毒XA株原核表达载体中获得VP1u基因,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,经酶切鉴定并测序验证后,获得真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u。将其转染至HeLa细胞,提取细胞总蛋白,用Western blot技术检测VP1u蛋白的表达。结果:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u,荧光显微镜下可见pIRES2-EGFP-VP1u转染HeLa细胞后表达EGFP蛋白而发出绿色荧光,Western blot证明VP1u蛋白在HeLa细胞中表达。结论:成功构建了携带人B19病毒VP1u基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-VP1u并在HeLa细胞中正确表达,为今后B19病毒VP1u基因疫苗的研究奠定基础。