猪细小病毒L株VP2基因片段的克隆及序列分析

对自行分离的PPVL株VP2基因片段进行克隆和测序。序列分析表明:L株VP2基因片段与其他PPV毒株的VP2基因片段的核苷酸同源性均在99.19%以上,氨基酸同源性在98.87%以上。表明L株与国内流行毒株之间同源性极为接近,其中与NADL-2(4973)株的亲缘关系最近(核苷酸同源性为99.81%,氨基酸同源性为99.62%)。在决定毒株组织嗜性的关键氨基酸位点上(378,383及436),L株与NADL-2株相同,据此推测L株的毒性与组织嗜性可能与NADL-2相似。

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用 Pichia 酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒 vp2 基因片段。首先用 Primer5.0 设计 1 对引物 P1、P2,以插入 IBDV vp2 基因的 PMD18-T-VP2 载体为模板,扩增出带有终止密码子的 1.4 kb 片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用SacⅠ内切酶线性化后,电击转化整合入 Pichia PastorisX-33 酵母菌,经高浓度 ZeocinTM 筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达 vp2 基因的酵母工程菌 X-33/ pPICZα-A-VP2。工程菌 72h 培养上清的 SDS-PAGE 电泳与免疫印迹结果显示,vp2 基因表达产物大小约为 55 kDa,比预期的 41kDa 大。凝胶薄层扫描结合 Bradford 蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的 28%,表达量可达 23 mg/ L。间接 ELISA 结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。

犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达

以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。