伪狂犬病病毒VP22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接ELISA方法筛选,经3次亚克隆后获得4株PRV VP22蛋白的单克隆抗体1D6、1D9、1B12和2C10。间接ELISA检测4株杂交瘤细胞传至15代均能稳定分泌抗体,且细胞上清液抗体效价均为1∶6400。经亚型鉴定,4株单克隆抗体的重链均是IgG1亚类,轻链皆属于κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体均可与PRV发生特异性反应,并鉴定出2个抗原表位;Western blot和共聚焦试验结果表明,VP22蛋白是病毒早期蛋白,且早期存在于细胞质,晚期移位至细胞核并在核中积累。本研究制备的单克隆抗体将为后续探索PRV VP22蛋白的功能提供材料支撑。

MDV VP22的N1-18是发挥蛋白转导功能必需的序列

血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)CVI988/Rispens弱毒株的VP22蛋白缺失201TKSERT206。为了进一步证实该缺失对MDV-1VP22蛋白转导功能和效率的影响,本研究通过将不同缺失型的VP22与EGFP相融合,转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光方法,检测VP22的蛋白转导现象。结果发现,EGFP-VP22具有微管结合、核膜结合、核酸结合、蛋白转导等特性;CVI988VP22与GA株VP22的转导效率相当,且只有完整长度的VP22具有明显的转导功能,其中,N端1～18aa对VP22的核定位及其蛋白转导功能的发挥意义很大。这一发现为利用MDV-1VP22携带其他目的蛋白转导,增强目的蛋白免疫原性及其治疗性功能具有重要的指导价值。

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDVCEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。

VP22的细胞间传递作用对HSV-tk/GCV的肿瘤细胞杀伤促进效应

目的 :探讨VP2 2的细胞间传递作用对HSV tk/GCV杀伤肿瘤细胞的促进作用。方法 :将VP2 2与报告基因 绿色荧光蛋白基因 (GFP)或前药酶基因 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV tk)构建在同一载体上 ,进行DNA序列分析鉴定 ;将此融合基因载体转染 2 93T或COS7细胞 ,免疫荧光分析确定转染情况和细胞间传递作用 ;在前药GCV不同浓度、转染与未转染细胞比例不同时 ,MTT法检测细胞增殖情况 ;利用转染细胞培养液上清培养未转染细胞 ,确定旁观者效应是否由培养液转移。结果 :PCR及序列分析显示融合基因插入载体正确 ;对 2 93T或COS7细胞转染率可达 2 5 %～ 3 0 % ,且证明融合蛋白已被表达并在细胞间传递 ;HSV tk与VP2 2融合后在前药GCV浓度低至 0 .1μg/ml时就可显示出细胞杀伤效应增强 ,并随着表达VP2 2 HSV tk细胞比例的增加 ,细胞杀伤作用增强。结论 :VP2 2介导的自杀基因产物的细胞间传递作用可解决自杀基因的低效细胞毒作用 ,明显增强细胞杀伤效应。

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体。重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定。结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36ku,与预期的大小一致。重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定,获得4株能够稳定分泌抗DEVVP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2B10、2G1、3F10和3G2。其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM。4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白。这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究。

VP22增强慢病毒介导的自杀基因治疗抑制人卵巢癌裸鼠腹腔种植瘤生长的研究

目的:探讨单纯疱疹病毒壳膜蛋白VP22的细胞间传递作用促进HSV-TK/GCV(单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦)系统对卵巢癌腹腔移植瘤的杀伤效应。方法:将慢病毒包装质粒、包膜质粒、转移载体质粒采用磷酸钙沉淀法共转染包装细胞293T,收集病毒上清,并建立人上皮性卵巢癌(3AO)细胞株腹腔移植瘤模型。单药组分为TK+生理盐水(NS)组、VP22-TK+NS组、NS+NS组,分别腹腔注射慢病毒TK、VP22-TK或NS1ml,继而腹腔注射NS;联合用药组分为TK+GCV组、VP22-TK+GCV组、NS+GCV组分别腹腔注射慢病毒TK、VP22-TK及NS,24h后腹腔注射GCV治疗。每组裸小鼠均为5只。观察各组裸鼠的生存时间及慢病毒的毒性作用。结果:平均生存时间TK+NS组、VP2-TK+NS组、NS+NS组、NS+GCV组、TK+GCV组、VP2-TK+GCV组分别为18.3±2.7d、18.4±1.9d,17.2±1.3d、18.7±1.9d、21±4d和46±22d,6组差异有显著性(χ2=24.81,P=0.002);并且VP2-TK+GCV组平均生存时间较TK+GCV组裸鼠明显延长(χ2=7.42,P=0.006)。结论:VP22介导的自杀基因产物的细胞间扩散作用可明显加强对体内肿瘤细胞的杀伤效应。

共表达PRRSVGP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

体内蛋白转导的研究进展

简要综述了几种能够携带药物跨越血脑屏障和细胞生物膜屏障的蛋白结构域的研究进展。

VP22短肽融合猪圆环病毒2型重组病毒样颗粒的构建及其鉴定

采用融合PCR方法将猪圆环病毒2型(PCV2)Cap基因和人单纯疱疹病毒Ⅰ型病毒(HSV-1)VP22蛋白转导域串联得到Cap-VP22基因,将其插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual构建pFast-Cap-VP22重组转移载体,通过转化含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含Cap-VP22基因的重组穿梭质粒rBac-2Cap-VP22。重组穿梭质粒转染昆虫细胞(Sf9),获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞,通过PCR、间接免疫荧光(IFA)、电镜观察对表达产物进行检测。结果表明,成功构建含双拷贝Cap-VP22基因的杆状病毒载体,IFA证实重组蛋白在Sf9细胞中获得正确表达,与PCV2阳性血清具有良好的反应原性;电镜观察结果显示细胞上清中的目的蛋白可装配形成直径约17nm的病毒样颗粒(VLPs);表明C端融合VP22蛋白转导域序列并不影响Cap蛋白的组装。本研究为进一步研制安全、高效的PCV2疫苗奠定基础。

VP22修饰的CD基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6脑胶质瘤体外实验研究

目的探讨病毒蛋白VP22在胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase，cD）基因工程化神经干细胞治疗大鼠C6胶质瘤中的作用。方法质粒pAdTrack-CMV-CD中PCR获取CD片段，克隆到慢病毒（1entivims）质粒pHIV-EGFP和pHIV-VP22-EGFP载体上，获得重组质粒pHIV—CD—EGFP和pHIV—VP22-CD—EGFP，采用酶切和PCR技术进行鉴定。病毒包装采用三质粒系统共同转染293T细胞。CD基因的表达采用逆转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）方法鉴定。Lentivirus-EGFP、lentivirus-CD-EGFP、lentivirus-VP22-EGFP和lentivirus—VP22-CD-EGFP四种慢病毒感染经体外原代培养、扩增的sD大鼠胎脑神经干细胞（Nerualstem cells，NSCs），体外与C6细胞按1：1比例共培养，并加入终浓度100mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC）培养3d后，MTT比色法测定细胞存活率。结果酶切和PCR证实，重组的慢病毒中含有CD基因。慢病毒lentivims-EGFP、lentivims—CD—EGFP、lentivirus—VP22-EGFP和lentivirus—VP22-CD—EGFP分别感染NSCs后与C6细胞共培养，在5-FC作用下，其细胞存活率分别为（95．57±4．83）％，（49．96±7．19）％，（94．254-4．32）％和（28．064-6．26）％。统计学处理，转染lentivirus—CD—EGFP和lentivirus—VP22-CD—EGFP组的细胞存活率明显低于其相应对照组lentivirus—EGFP和lentivirus—VP22-EGFP（P〈0．01）；其中转染lentivirus-VP22-EGFP组的细胞存活率又明显低于lentivirus-EGFP组（P〈0．01）。结论VP22能够在体外增强CD基因修饰的NSCs抗C6胶质瘤疗效。

VP22-CD基因工程化载体对胶质瘤细胞体外杀伤作用的研究

目的构建CD以及VP22-CD基因工程化载体，并探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤作用。方法利用聚合酶链式反应（PCR）得到CD以及VP22基因片段；利用In—fusion基因克隆方法将得到的基因片段插入到pEGFP—N1载体中，构建CD以及VP22-CD基因工程化载体；利用脂质体转染的方法将构建的基因工程化载体转染到胶质瘤细胞c6及U87细胞中，并通过体外光镜及荧光显微镜观察转染率；利用MTT比色法评价加入前药5-氟胞嘧啶后对转染后胶质瘤细胞的杀伤率。结果（1）将CD基因或VP22-CD融合基因插入到pEGFP—CD载体中，构建得到pEGFP—CD以及pEGFP—VP22-CD载体。（2）pEGFP—CD及pEGFP—VP22-CD载体可转染入c6或U87胶质瘤细胞，转染率分别为2．5％和3．7％以及2．0％和4．1％。（3）在c6或U87细胞中转染pEGFP—CD或pEGFP-VP22．CD载体并加入前药5．氟胞嘧啶后，细胞的存活率分别为（30．36±0．63）％和（11．75±1．01）％以及（28．78±3．62）％和（18．26±2．27）％，与转染pEGFP—N1组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05）。（4）在C6或U87细胞中加入前药5-氟胞嘧啶后，转染pEGFP—VP22-CD组与转染pEGFP—CD组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论CD／5-FC系统在体外对恶性胶质瘤细胞具有显著的杀伤作用和旁观者效应；并且穿梭蛋白VP22可进一步促进系统对细胞的杀伤作用。

HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究

目的构建人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）病毒蛋白22（VP22）及microdystrophin基因融合表达重组质粒，体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性，为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症（DMD）奠定基础。方法从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因，然后克隆至真核表达载体pAVX1中，构建重组质粒pAVP22；再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒，获得microdystrophin基因，片段回收后定向插入质粒pAVP22中，获得重组质粒pAVP22-MICDYS；然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞，通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达；最后收集转染后3T3细胞上清。感染人间充质干细胞（MSCs），检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdystrophin融合蛋白的转导。结果成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒，并在体外得到了很好表达；同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率。并可介导VP22-microdystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCs间的转导。结论该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础。

细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究

目的构建表达细胞穿透肽融合蛋白第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表达质粒,在食管癌细胞Eca109细胞中验证细胞穿透肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用。方法通过本实验室前期构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22,转染至Eca109细胞,以pcDNA3空质粒转染作为阴性对照,细胞免疫荧光法检测各组PTEN蛋白表达情况,Western blot法检测各组PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(pAkt)蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术测细胞凋亡率。结果与pcDNA3相比,pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109细胞增殖(P<0.05),促进Eca109细胞凋亡(P<0.05);pcDNA3-PTEN-VP22抗肿瘤活性显著高于pcDNA3-PTEN(P<0.05),pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表达显著低于pcDNA3-PTEN(P<0.05)。结论细胞穿透肽VP22能增强抑癌蛋白PTEN对Eca109细胞体外抗肿瘤活性,其机制可能与其下调p-Akt表达水平有关。

马立克病病毒被膜蛋白VP22的研究进展

马立克病病毒(MDV)感染鸡可导致外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官肿瘤和免疫抑制。VP22蛋白是α-疱疹病毒被膜蛋白特有的成分,它具有独特的蛋白转运能力,能够将与病毒复制有关的蛋白质以及核酸等物质转运到细胞中,并且能够通过抑制cGAS-STING信号通路来帮助病毒逃避宿主的天然免疫屏障,但是VP22是否与MDV的免疫逃逸有关还未见相关报道,仍有待进一步研究。本文主要从VP22的细胞核定位、蛋白转导以及免疫逃避等方面进行综述,加深对MDV病毒蛋白VP22的认识。

VP22融合猪细小病毒VP2蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

旨在利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达融合VP22短肽的重组猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2,分析其免疫原性。以PPV N株为模板,通过重叠延伸PCR技术分别将VP22融合到VP2基因的N端或C端,构建重组杆状病毒rBV-VP2、rBV-VP22-VP2和rBV-VP2-VP22,通过感染昆虫细胞进行重组蛋白的表达,并在小鼠上初步验证其免疫原性。间接免疫荧光和Western blot分析结果表明表达产物均能与鼠抗PPV抗体发生特异性反应;透射电镜观察到rBV-VP2、rBV-VP22-VP2的表达产物可装配形成直径约22～24 nm的病毒样粒子,VP2-VP22没有观察到病毒样粒子。PPV ELISA抗体检测结果显示,3种表达产物均能有效诱导小鼠产生PPV特异性抗体,其中VP2、VP22-VP2组产生抗体水平与PPV灭活苗相当;细胞因子检测结果显示,3种表达产物均能有效刺激细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌,其中VP22-VP2组IL-2和IFN-γ的含量要显著高于VP2和PPV灭活苗组及重组蛋白VP2-VP22组,表明VP2 N端融合VP22蛋白的免疫效果要优于其C端,VP22-VP2虽不能提高VP22蛋白的体液免疫效果,但具有增强小鼠机体细胞免疫反应的能力。