A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物,随后将纯化的VP3重组蛋白皮下多点注射新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot分别对抗体效价、反应性和特异性进行鉴定。结果显示:重组VP3蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 kDa;制备的VP3蛋白多克隆抗体能与VP3重组蛋白和SVA发生特异性反应,其ELISA效价达1:10000以上,Western blot和IFA效价达1:5000。综上,本研究成功制备了SVA VP3多克隆抗体,其具有较高的效价和特异性,可为后续SVA致病机制及检测方法等研究奠定基础。

IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

应用RT-PCR技术从鸡IBDV总RNA中克隆出893bp的VP3基因,并将其进一步克隆于pET-28a载体T7启动子的下游,构建了pETVP3原核表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3)中成功表达了35.5,33kDa的鸡IBDVVP3蛋白。经SDS-PAGE和Westernblotting分析,VP3表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清特异性反应。

应用GPV VP3基因重组原核表达产物建立检测抗体的ELISA方法研究

利用鹅细小病毒（GPV）VP3基因的原核表达蛋白作为包被抗原建立了检测GPV抗体的间接ELISA及Dot-ELISA方法。经确定两种方法的抗原包被浓度为125μg／mL，其中间接-ELISA 100μL／孔、Dot-ELISA 5μL／点。间接-ELISA中HRP标记的兔抗鹅IgG的工作浓度是1：200，检测血清的最适稀释度是1：400，阳性判定标准为OD492≥0．20，且P／N≥2．0。用此方法检测弱毒疫苗免疫血清，其抗体滴度在1：400～1：51200。Dot-ELISA的结果与间接-ELISA的结果一致。

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

鹅细小病毒不同毒株VP3基因的序列分析比较

分别将GPV 4个分离株通过PCR技术 ,从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段 ,并与PMD18_T质粒载体连接 ,转化到感受态大肠秆菌TG1中 ,提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后 ,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明 :VP3基因全长 16 0 5bp ,编码 5 34个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP3基因同源性较高(95 .6 4 %～ 99.81% )。但强弱毒株间也存在一定差异。

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPVH1分离株接种于 13日龄非免疫鸭胚 ,收集接毒后 3～ 7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒 ,通过PCR技术 ,从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段 ,经酶切鉴定后直接与pMD 18_T质粒载体连接 ,转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后 ,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明 :鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长 16 0 5bp ,编码 5 34个氨基酸 ,与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为 98.5 % ,氨基酸序列同源性为98.3% ,表明这二个毒株亲缘关系相近。

鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株VP3基因,测序后将VP3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-VP3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中。表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性。

共表达鹅细小病毒VP3-gIL2重组乳酸杆菌的构建及其口服免疫评价

笔者拟构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3和鹅白细胞介素-2(IL-2)的分泌性重组乳酸杆菌,评价口服表达融合蛋白GPV VP3-gIL2的重组乳酸杆菌的免疫效果。通过酶切将VP3基因和IL-2基因连接,并在其5′端连入乳酸杆菌的信号肽基因SP,亚克隆到乳酸杆菌整合表达载体pMJ67,电转化入干酪乳杆菌L.CECT5276,SDS-PAGE和Western blot法鉴定重组菌GPVVP3-gIL2融合蛋白的表达活性。将重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅后检测血清GPV抗体、小肠黏液sIgA和脾淋巴细胞增殖情况,评价其免疫效果。结果表明,酶切和测序结果表明成功构建重组表达载体pMJ-SP-GPVVP3-gIL2,PCR证实质粒pMJ-SP-GPVVP3-gIL2成功整合到乳酸杆菌基因组;Western blot表明重组乳酸杆菌分泌表达的融合蛋白GPVVP3-gIL2能与GPV阳性血清特异性结合;淋巴细胞增殖试验表明口服重组菌后能特异地刺激脾淋巴细胞增殖,且在第4、5、6周明显高于GPV VP3组和gIL2组;重组乳酸杆菌口服免疫雏鹅可以产生抗VP3蛋白抗体,且具有中和活性的抗体显著高于GPV VP3组;小肠黏液sIgA细胞生成的数量自第2周较GPV VP3组和疫苗组显著上升。动物攻毒试验结果显示GPV VP3-gIL2融合蛋白免疫组能够获得85%的保护率,表明所构建的重组乳酸杆菌口服后对GPV的攻击具有较好的免疫保护作用。本试验成功构建能稳定表达GPV VP3-IL2融合蛋白的口服乳酸杆菌工程菌,为研究其作为口服疫苗奠定了基础。

小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其诱导小鼠和鹅中和抗体的初报

PCR 扩增小鹅瘟病毒(GPV)CHv 株 VP3基因并克隆入 pMD 18-T-Simple 载体,亚克隆正向插入到真核表达质粒 pcDNA3.1(+)CMV 启动子下游多克隆位点,经 PCR 和HindⅢ与 BamH Ⅰ双酶切鉴定表明成功构建了 GPV VP3基因疫苗(pcDNA3.1-GPV-VP3)。该疫苗以200μg/只肌注免疫 Balb/c 小鼠和鹅,同时分别设肌注 PBS 和 pcDNA3.1(+)作为对照,于免疫后第30、45、60、75、90、105天应用鸭胚原代成纤维细胞(DEF)进行微量中和试验检测小鼠和鹅血清抗100 TCID50 GPV 的抗体效价。结果表明,pcDNA3.1-GPV-VP3免疫小鼠第30天可检测到抗 GPV 的中和抗体,抗体效价缓慢上升至90天达到高峰(平均1:135.8)后下降,105天仍高于75天;免疫鹅的中和抗体效价呈现与小鼠类似的规律,第90天达到高峰(平均1:98.5)。因此,pcDNA3.1-GPV-VP3具有良好的免疫原性,肌注免疫小鼠和鹅后能够诱发产生抗 GPV 的中和抗体,有进一步开展临床研究和应用的前景。

禽脑脊髓炎病毒结构蛋白VP3基因真核表达载体的构建及其免疫

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒(AEV)1 143株结构蛋白VP 3基因的序列,设计1对特异性引物,经PCR从原核表达载体pET-VP 3中扩增出VP 3基因片段,克隆入T载体经测序证明所扩增的序列正确。从T载体切下目的片段,定向克隆入pcDNA 3.1(+)载体,转化大肠杆菌DH 5α,鉴定后大量提取质粒,转染CO S-1细胞,用间接免疫荧光检测到目的基因的表达。将重组载体对BALB/c小鼠进行免疫,结果2次免疫后就检测到特异性抗体,表明该载体在动物体内有较高的表达水平,可用于动物体内免疫,为进一步研究AEV的核酸疫苗打下了基础。

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明,表达的VP3蛋白与天然的IPNVVP3蛋白一样具有相同的抗原性。试验利用原核表达系统成功地高效表达了IPNVVP3蛋白,融合蛋白以可溶性形式存在,并制备了高效价的抗血清。

鹅细小病毒VP1与VP3非重叠序列的克隆与原核表达

根据鹅细小病毒 GPV H1株基因组核苷酸序列设计了一对引物 ,对其结构蛋白 VP1与 VP3非重叠核苷酸序列进行 PCR扩增 ,并克隆到表达性载体 p GEX- 6 p- 1,经酶切鉴定筛选出阳性克隆 ,并转化到大肠杆菌 BL 2 1(ED3) plys S进行原核表达 ,并用 SDS- PAGE鉴定 ,结果表明融合蛋白在表达性细菌 BL2 1中重获得了高效表达。

pVVP3和pVHN核酸疫苗的构建、表达及对肿瘤细胞的作用

用pVAX1载体构建抗肿瘤核酸疫苗 .将鸡贫血病病毒 (CAV)的VP3基因和鸡新城疫病毒(NDV)HN基因插入载体pVAX1的多克隆位点 ,构建了 2个重组基因疫苗pVVP3和pVHN .转染OS732细胞 ,Western印迹及血凝试验检测HN基因表达状况及表达产物的活性 .RT PCR、DNALadder、TUNNEL染色检测VP3基因的表达及表达产物诱导OS732细胞凋亡作用 .酶切鉴定证实成功地构建了两个核酸疫苗 ,并能在真核细胞内表达 .含HN的核酸疫苗pVHN表达后具有血凝活性并致肿瘤细胞表面唾液酸含量降低 (P <0 0 5 ) .pVVP3的转染能导致OS732细胞凋亡 ,凋亡率可达87% .试验结果表明 。

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗

目的 :寻求有效的肿瘤基因治疗方法 ,研究新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因在无胸腺裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法 :建立BALB/c裸小鼠荷人结肠癌模型 ,瘤内注射脂质体包裹的真核重组子 pVHN和pVVP3。观测 pVHN和pVVP3治疗荷HCT裸鼠的效果 ,免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl 2和PCNA的表达。结果 :经HN基因和VP3基因联合治疗组的小鼠与荷瘤对照组小鼠相比 ,肿瘤体积明显缩小 ,抑瘤率可达 70 %。病理组织切片表明 ,治疗组裸鼠体内肿瘤细胞大量凋亡 ,局部地方可见细胞消失。免疫组化表明 ,Bcl 2和PCNA蛋白在荷HCT裸鼠对照组与各治疗组均有表达 ,其中Bcl 2表达在荷瘤对照组与pVHN治疗组差异有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,PCNA表达在荷瘤对照组与 pVHN +pVVP3治疗组差异极其显著 (P <0 .0 1)。结论 :NDVHN基因与凋亡素VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用 ,可诱导其凋亡 ,其凋亡可能与下调Bcl 2表达有关。

鹅细小病毒强毒YBLJ分离株的分离鉴定与vp3基因的进化分析

为分离鹅细小病毒(GPV),本研究将疑似GPV感染鹅的组织样品接种SPF鹅胚进行病毒分离和鉴定。结果显示,第4代病毒对12日龄鹅胚的平均致死时间为96 h,ELD50为10-4.6/0.5 mL,PCR和琼脂扩散试验均呈GPV阳性反应,负染电镜下可观察到直径20 nm～25 nm的圆形或六角形病毒粒子,病毒可以被GPV标准阳性血清完全中和,回归雏鹅后表现典型的GP临床症状和特征性病理变化,发病率和致死率均为100%。分离株GPV的vp3基因全长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外有代表性11株GPV vp3基因的核苷酸同源性为94%～98%,氨基酸同源性为96%～99%。将该分离病毒命名为GPV YBLJ分离株。

传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白在干酪乳杆菌的表面表达

为获得传染性胰腺坏死病毒(IPNV)VP3蛋白在菌体表面表达,本研究将IPNV VP3基因定向插入乳酸杆菌表面表达型载体pPG1,构建的重组质粒pPG1-VP3电转化干酪乳杆菌,获得了重组干酪乳杆菌表达系统pPG1-VP3/Lactobacillus casei393。经1%糖诱导表达后,SDS-PAGE和western blot检测表明,有约31ku蛋白得到了表达,其大小与理论值相符;诱导表达的菌体进行间接免疫荧光试验表明,重组蛋白在菌体表面获得了表达。该病毒VP3蛋白在乳酸菌的表面表达为进一步探讨传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白免疫原性及相关功能奠定了基础。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）转染鹅胚成纤维细胞（GEF），每隔12h检测VP3蛋白的表达情况，同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅，于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105d采血，进行淋巴细胞增殖试验（MTT法）。结果，转染后第24h即可在GEF中检测到GPVVP3蛋白，第60h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490nm值在免疫后第35d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14～63d、第7～63d的D490nm值分别与PBS对照组差异板显著；肌肉注射组及基因枪组免疫后第21～49d的D490nm值显著高于弱毒疫苗对照组；肌肉注射组及基因枪组免疫后第14～63d的D490nm值板显著高于空质粒对照组。表明，基因枪轰击和肌肉注射pcDNA—GPV—VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。

鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较

为阐明小鹅瘟基因疫苗与弱毒疫苗诱导细胞免疫和体液免疫的不同机理,将小鹅瘟VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按6μg/只基因枪轰击和100μg/只肌肉注射,小鹅瘟弱毒疫苗按100μL/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时以pcDNA3.1(+)和生理盐水为对照。于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77、105d采集抗凝血,用淋巴细胞转化试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞的转化效果和CD4+、CD8+ T淋巴细胞的动态变化,另外,在以上10个时间段以及免疫后第133、161、189、217d分别采集凝血,用间接ELISA检测小鼠特异性IgG抗体水平。结果显示,pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组。3个免疫组小鼠都能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答,并且基因疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫应答比弱毒疫苗免疫组强。

鸡贫血病毒vp3基因体内抑瘤效应的实验研究

目的 观察鸡贫血病毒 ( chicken anem ia virus,CAV) vp3基因的体内抑瘤效应。方法 分别将 pc DNA- vp3(含 vp3基因的真核表达载体 )、pc DNA3 (空载体 )和小鼠腹水型肝癌细胞株 H2 2混合后 ,接种于 BAL B/ c小鼠皮下。几天后 ,处死动物 ,取肿瘤组织称重 ,比较试验组和对照组瘤重差异 ,确定 vp3基因的抑瘤效应。TU NEL 法鉴定 vp3在体内诱导肿瘤细胞死亡的方式。结果 注射 vp3基因的试验组肿瘤生长率明显低于注射空载体的对照组。TUNEL 试验的结果也表明 ,鸡贫血病毒 VP3蛋白在体内以凋亡方式诱导肿瘤细胞死亡。结论 预示