贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。

郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析

为了解郑州地区犬细小病毒(CPV)的流行特征及遗传变异情况,采集81份2017—2022年郑州市疑似感染CPV犬的粪便或肛门拭子进行PCR检测。随机挑选出21份经PCR检测的CPV阳性样本,扩增其VP2基因,连接至载体并测序,用MegAlign软件对流行株进行同源性和氨基酸变异分析,并通过MEGA6.0软件构建基因遗传进化树。结果显示:2017—2018年郑州地区CPV流行基因型为New CPV-2a亚型,2019—2022年则以CPV-2c亚型为主导。21株CPV流行株与疫苗株的核苷酸同源性为98.3%~99.0%,其中CPV-79流行株与疫苗株的核苷酸同源性最低,仅为98.3%,且该毒株在VP2蛋白GH环区出现多位点氨基酸突变;部分CPV-2c亚型流行株第5和370位氨基酸出现A到G和Q到R的变异。研究结果表明:郑州地区当前流行基因型为CPV-2c亚型,虽出现多位点氨基酸突变,但未形成明显的国内进化分支。值得注意的是,New CPV-2a亚型在进化过程中形成了不同分支且存在抗原突变的风险。本研究丰富了郑州地区CPV的分子流行病学调查数据,也为我国CPV流行疫苗株的研制奠定了基础。

辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株2022年辽宁沈阳地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)LN3株VP2蛋白的分子特征。【方法】利用FPV胶体金试纸条对临床上表现呕吐、腹泻等症状的患病猫粪便进行检测,提取该病猫粪便的病毒DNA进行FPV VP2基因PCR扩增及测序,使用Seqman软件对序列进行拼接。将所获序列与NCBI数据库中FPV和犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的VP2基因进行相似性比对及遗传进化分析。使用生物信息学软件对该毒株VP2蛋白进行预测,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、糖基化位点、亚细胞定位、二级结构、三级结构等。【结果】FPV LN3株VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;与GenBank上登录的15株FPV同属一个大分支,相似性为98.9%~99.7%;与CPV处于不同分支上。生物信息学软件预测显示,FPV LN3株VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;含有7个潜在N-糖基化位点、86个O-糖基化位点和50个磷酸化位点;VP2蛋白在细胞质、细胞核、线粒体中的可能性分别为43.5%、34.8%和21.7%;VP2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-转角分别占61.82%、8.90%、24.32%及4.97%,三级结构预测结果与其一致;VP2蛋白共有20个抗原表位。【结论】VP2是FPV遗传变异的关键基因,FPV LN3株VP2蛋白属于亲水性、非跨膜稳定蛋白,共存在20个抗原表位。试验结果为进一步研究FPV VP2蛋白功能及研发新型疫苗提供理论依据。

犬细小病毒CPV-2c型亚洲株分离鉴定及VP2基因序列分析

为探明北京某犬场犬的死亡原因,从患有肠道出血的犬肛拭子中分离出1株犬细小病毒,试验通过PCR、血凝和间接免疫荧光试验方法对毒株进行鉴定,并对VP2基因进行克隆测序和序列分析,确定其遗传分支。结果表明,该分离株属于犬细小病毒CPV-2c型,命名为CPV-BJ21株。应用犬细小病毒单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,结果为阳性;基因序列分析表明,分离株与犬细小病毒为同一进化分支,VP2基因核苷酸序列与中国四川的CPV-2c(MH476581.1)同源性达99%,与亚洲分离的犬细小病毒之间亲缘关系较近。VP2氨基酸序列在第A5G、S297A、D426E位出现了氨基酸突变;在F81细胞上传3代后,病毒液的血凝效价稳定于210。本研究可为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的研究提供参考依据。

大鼠细小病毒KRV/QD/2022株的分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了解山东地区Kilham细小病毒(kilham rat virus,KRV)的流行情况并探究其分子生物学特征,本试验从某疑似感染KRV的大鼠养殖场分离病毒并对其致病性进行研究。通过观察患病大鼠的临床症状和病理变化并使用PCR方法检测病料确定是否为KRV病毒感染。将阳性病料接种到大鼠神经胶质瘤细胞C6上分离KRV并对其VP2全长测序并构建进化树,通过病毒TCID 50测定、血凝和血凝抑制试验及动物回归试验确定分离株的致病性。结果显示养殖场中流产母鼠子宫体积变小,子宫内胎儿全部死亡或部分死亡。将阳性病料接种于C6细胞上,盲传三代后出现明显病变,对分离株VP2基因进行测序发现该分离株与LG/HN/CHN/2016株相似度最高为98.51%,与其他目前已知分离株的VP2同源性在95.20%~97.31%之间。分离株传到7代后的TCID 50为105.56/0.1 mL,血凝效价为1∶1280,血凝抑制效价为27,证明分离株确为KRV,将其命名为KRV/QD/2022。动物回归试验证明该分离株能感染大鼠并导致大鼠出现流产、繁殖障碍等特征性病变。上述结果显示,本研究成功分离出了一株KRV细小病毒并进行了系统的研究,为该病毒的诊断和预防提供了一定的依据。

猫泛白细胞减少症病毒分离鉴定及VP2基因的遗传变异分析

为分析北京地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)的流行毒株及其VP2基因遗传变异情况,对FPV胶体金试纸条检测结果为阳性的病死猫组织进行病毒分离,通过细胞病变、荧光定量PCR、间接免疫荧光和全基因组测序等试验,分离鉴定到1株FPV,命名为FPVBJ-CP/2022株。对决定病毒宿主范围和抗原性的VP2基因系统进化树分析表明,分离株与FPVJF-3株、FPVBeijing-01/2018聚为一支,与FPV疫苗株、CPV群亲缘关系较远。VP2蛋白主要功能位点分析结果显示,VP2蛋白中决定病毒抗原性和宿主嗜性的10个关键位点氨基酸均未发生突变,但该分离株的VP2蛋白序列与GenBank其他FPV毒株的VP2蛋白相比,91位氨基酸由丙氨酸(A)突变为丝氨酸(S),505位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D),该突变是否对FPVBJ-CP/2022株VP2蛋白的功能和生物学特性造成改变,有待于进一步研究。论文通过对毒株的遗传变异分析,为更好地预防和控制FPV感染提供了研究基础。

汝州市犬细小病毒的PCR检测及VP2基因序列分析

为了解汝州市犬细小病毒的流行和变异情况,本研究调查了汝州市3家动物诊所接诊的20例疑似感染犬细小病毒病例。PCR结果显示,15份样本为犬细小病毒阳性。VP2蛋白氨基酸序列分析结果显示:12株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2c,3株犬细小病毒的基因亚型为CPV-2a;分离得到的15株犬细小病毒其氨基酸序列同源性为99.1%~100.0%,与疫苗株的同源性为97.5%~98.6%,与其他国内外参考毒株的同源性为98.0%~100.0%;分离的12株CPV-2c型毒株与我国广西等地分离的CPV-2c型毒株具有较近的亲缘关系;分离的3株CPV-2a型毒株与我国广州等地分离的CPV-2a型毒株属于同一支。对汝州市犬细小病毒的流行调查,为该地区犬细小病毒病的防控提供了理论基础。

广西地区犬细小病毒检测及VP2基因序列分析

为了调查广西地区犬细小病毒(CPV)的优势毒株及其遗传变异情况,试验利用PCR方法对采自广西地区的423份犬血清样本进行CPV检测并扩增其VP2基因,利用MegAlign软件进行同源性比对并分析VP2蛋白主要突变的氨基酸位点,同时利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建遗传进化树。结果表明:共获得55份CPV阳性血清样本,阳性率约为13.0%。PCR扩增得到大小约为1755 bp的VP2基因。55株分离毒株之间的相似性为98.6%~100%;分离毒株与国内外参考毒株的相似性为97.4%~100%,与疫苗株Pfizer/vaccine/06的相似性为98.3%~98.9%。扩增序列的推导氨基酸主要在第5,297,370,426,440位发生变异。在55株分离毒株中,有32株为New CPV-2a亚型毒株,20株为CPV-2c亚型毒株,3株为New CPV-2b亚型毒株。55株分离毒株形成3个主要的流行分支,与国内参考毒株的亲缘关系较近,而与国外参考毒株、猫细小病毒的亲缘关系较远。说明New CPV-2a、CPV-2c、New CPV-2b亚型毒株在广西地区流行广泛,正逐步取代CPV-2a和CPV-2b成为广西地区主要流行的亚型。

北京地区猫泛白细胞减少症病毒VP2基因的遗传进化分析

猫泛白细胞减少症病毒(FPV)对猫科动物危害较大,病毒VP2基因在决定其抗原性和宿主范围中起重要作用。为了解FPV的流行状况及其VP2基因遗传变异和进化方向,本研究对北京地区宠物医院疑似感染FPV的猫采样,共采集到16份粪便样品;对FPV VP2基因进行PCR扩增和测序,得到12条长度1755 bp的VP2序列;利用软件将获得的VP2基因序列与国内外报道的流行株进行同源性比对、遗传进化分析,结果显示,12条VP2序列均属于G1基因群,与参考株M38246相比亲缘关系较远。本研究为北京地区猫泛白细胞减少症的有效防控提供理论依据。

2007—2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析

为了解2007-2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株EV71(其中3株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本,2株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本),提取基因组RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到VP4基因片段,并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件与GenBank中的EV71 VP4基因进行序列及病毒型别分析。结果表明,所测得的8株EV71 VP4基因全长均为207bp,编码69个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为7×103。8株EV71病毒VP4基因的核苷酸同源性在94%～100%,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为82%～100%,与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4编码的氨基酸在第7和54位不同外(印度株:7位蛋氨酸,54位苏氨酸;其余株7位苏氨酸,54位丙氨酸),这8株EV71VP4编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8株EV71病毒VP4与文献报道的3株重症感染病毒株VP4(BrCr、MS和NCKU9822)核苷酸有较大差别,而8株病毒株中从重症感染(BJ97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243)与轻症感染(BJ25、BJ47、BJ65和BJ67)分离到的毒株之间VP4基因序列未见明显改变,只有几个核苷酸存在差别。VP4核苷酸序列的进化树分析表明,这8株EV71均属于C4亚型,显示2007-2008年北京地区流行的EV71的VP4基因相当保守,分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71的VP4基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示,近2年来北京地区所流行的EV71属C4亚型。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析

从北京地区疑似细小病毒感染的犬粪拭子中成功分离鉴定出14株犬细小病毒(CPV)毒株,并对其完整的VP2和NS1基因进行了序列分析。结果表明,鉴定到的14株CPV毒株中,7株为New CPV-2a型,7株为CPV-2c型。此外,NS1的19、33、293、588、624和656位氨基酸以及VP2的13、574位氨基酸为新鉴定的氨基酸突变位点。基于VP2、NS1基因的系统进化分析表明,大部分的New CPV-2a型和CPV-2c型毒株与广西南宁和吉林长春地区的分离毒株亲缘关系密切,说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。本研究为更好地开展犬细小病毒流行病学调查提供了有益借鉴,也为深入研究犬细小病毒变异和传播的分子机制奠定了基础。

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP 2基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及生物学特性分析

鸡传染性法氏囊病(IBD)是一种严重危害养禽业的高度致死性和免疫抑制性传染病。为研制IBD重组火鸡疱疹病毒(HVT)活载体疫苗,本研究构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)保护性抗原VP2基因的重组HVT并对其体外生物学特性进行了分析。通过RT-PCR扩增IBDV超强毒株VP2基因并克隆入pCI载体,获得重组真核表达质粒pCI-VP2。用限制性内切酶将携带CMV启动子的VP2基因表达框架切下,连接于入门质粒pENTR,构建获得重组入门质粒pENTR-VP2。将pENTR-VP2与HVT重组黏粒H3-Kan/ccdB进行LR重组反应,构建重组表达黏粒H3-VP2。用H3-VP2与其他4个相互重叠并覆盖HVT全基因组的黏粒共同转染鸡胚成纤维细胞(CEF),拯救获得重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF中连续传至20代后用PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行检测,并绘制重组病毒体外生长曲线,分析其体外复制特性。结果表明,重组病毒rHVT-VP2能够稳定表达VP2蛋白,rHVT-VP2在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。重组病毒rHVT-VP2免疫鸡后能够诱导产生IBDV中和抗体,并对IBDV强毒株攻击引起的死亡提供90%免疫保护。重组病毒rHVT-VP2的构建为研制IBD重组HVT活载体疫苗奠定了基础,对IBD的防控具有重要意义。

猪细小病毒潍坊株的分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了分析猪细小病毒(porcine parvovirus virus,PPV)VP2基因遗传情况,从山东省潍坊地区某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到一株病毒,将病料处理后接种PK-15细胞,观察细胞病变,采用血凝和血凝抑制检测、电镜观察及对病毒VP2基因进行PCR扩增并进行遗传进化分析。结果显示:病毒接种到PK-15细胞后产生明显的圆缩、拉网、灶性脱落等病变;分离毒可凝集豚鼠红细胞,能被已知PPV阳性血清中和;电镜观察病毒为近似圆形、无囊膜、大小不一的病毒粒子,直径约20 nm;对病毒的VP2基因用PCR方法扩增后测序并进行遗传进化分析,测序后确定分离株为PPV,将其命名为PPV SD-21。VP2基因进化树发现,PPV SD-21株与Kresse株和NADL-2株等分离株处于同一分支,遗传距离较近,属于PPV基因Ⅰ型,PPV SD-21株与GenBank中PPV基因Ⅰ型中的10株PPV参考毒株的同源性为97.5%~99.8%,其中与NADL-2株的同源性为99.8%。PPV SD-21株的VP2基因序列只是个别碱基发生变化,所编码氨基酸未发生变异。上述实验结果说明该分离病毒为猪细小病毒基因Ⅰ型弱毒株,该毒株的分离鉴定可为猪细小病毒的诊断和流行病学研究奠定基础。

传染性法氏囊病病毒YL051、YL052的分离及其VP2基因高变区序列的比较分析

应用鸡胚绒毛尿囊膜接种的方法，从一个疑患传染性法氏囊病的鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）（分别命名为YL051和YL052）；利用反转录-聚合酶链式反应技术扩增分离株VP2基因的高变区序列，并采用限制性内切酶分析技术和核苷酸序列测定技术，对分离株进行致病型鉴定及其基因差异的分析。结果表明：分离株YL051属IBDV的超强毒株（vvIBDV），而YL052株既具有强毒株的特征即七肽区（SWSASGS）和279D，但同时也具有284T的弱毒株特征，可能属于介于强毒株与弱毒株之间的一个中间型。与国内外参考毒株的序列比较分析发现：YL051与其他vvIBDV的核苷酸同源性达94％～97％；YL052则与经典毒株STC、疫苗株B87的核苷酸同源性均为94．3％。

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变(CPE),分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。

超强毒IBDV细胞克隆化毒回归鸡后的致病性与VP_2基因高变区的分子变化

为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性及其VP2基因高变区的分子变化,以vvIBDVGX8/99株囊毒为研究对象,将该毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传。该病毒在CEF上传至22代时开始引发CEF细胞病变,随之在96孔细胞培养板上用无限稀释法连续克隆2次后获得了4个病毒克隆,再将该4个病毒克隆分别连续回传3～5周龄SPF鸡10代。分别比较4个克隆毒及其回传SPF鸡后不同传代毒,对4～6周龄SPF鸡的致病性及VP2高变区氨基酸分子的变化,结果表明,4个克隆化毒的细胞培养毒对SPF鸡只有0～6 7%的致死率,不同克隆毒的SPF鸡传代毒对SPF鸡的致病性却都逐渐增强,但程度差异很大,其中克隆#5在回鸡1、5和10代后的致死率从0分别增加到10%、20%和27%;克隆#4从6 7%增加至13%、17%和23%;但克隆#1和#3的致病性变化相对较小。相对于原始囊毒及鸡胚毒,4个克隆化毒在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有10个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致,在回鸡传代导致对鸡毒力增强的过程中,这10个位点中大多数氨基酸不再变化,只有第253位和256位氨基酸从囊毒的Q和I变为细胞适应毒的H和V后,有些病毒克隆回鸡至第10代时又变为原囊毒的Q和I。

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物，位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端，通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ，扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后，分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理，结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）， Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）， Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）， Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）， Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）；５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异，而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比，至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异，这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。

4株IBDV的分离鉴定及VP2基因序列分析

通过接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)、DF-1细胞和琼脂扩散试验,对2010～2012年间收集于河南地区疑似鸡传染性法氏囊病病料,进行鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的分离、鉴定,得到4株IBDV;应用RT-PCR对分离株VP2基因进行扩增、克隆和序列测定后,分析比较4个分离株与参考毒株的VP2序列。结果表明:LY株属于超强毒株,与已发表的vvIBDV D6948株、OKYM株、UK661株、GZ/96株亲缘关系较近,核苷酸同源性达97.9%～98.2%;ZZ株属于强毒株,与标准强毒株52/70株亲缘关系较近,核苷酸同源性为97.8%;AY、XC株不仅具有弱毒株的特征,同时又具有变异毒株的特征,属于变异弱毒株,与标准弱毒株CU1的亲缘关系最近,核苷酸同源性达99.0%～99.3%。证明河南区域同时存在着不同毒力的IBDV毒株,病毒变异呈多态性。

传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区序列分析

根据传染性法氏囊病病毒 (IBDV)VP2基因cDNA序列 ,在VP2基因高变区设计一对引物 ,用RT_PCR方法扩增IBDV分离株JS3和JS4。将扩增片段克隆后以双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。JS3和JS4的同源性最高达 98% ,与已发表的vvIBDV、IBDV变异株、IBDV经典株及IBDV弱毒株核苷酸序列的同源性在 92 %～ 98%之间。根据IBDV的大ORF推导出该片段编码蛋白的氨基酸序列 ,JS3和JS4的同源性最高达 97% ,与上述其它病毒的同源性在 91 %～ 97%之间 ;七肽区的氨基酸序列 ,在强毒株完全相同 ,而在弱毒株有一个丝氨酸突变成了其它氨基酸。