RHDV CD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97.5%,与其它毒株的同源性在92.0%～96.6%之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi-co-89株同源性最高为99.4%,与其它毒株的同源性在96.6%～98.3%之间。

兔出血症病毒VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDV CD株人工感染家兔，发病死亡后，取肝脏匀浆，用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物，采用RT-PCR方法扩增了PHDV表壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后，选行序列测定。测序结果表明，VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDV VP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示，CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％．与其它毒株的同源性在92．0％-96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexico-89株同源性最高为99．4％，与其它毒株的同源性在96．6％～98．3％之间。

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。

Vps4b基因敲除鼠上皮根鞘中细胞角蛋白14和增殖细胞核抗原的表达

目的研究Vps4b基因突变对上皮根鞘(HERS)中细胞角蛋白14(CK14)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法取出生后(P)5、9、11、15、19d的小鼠的双侧下颌组织,石蜡包埋后获得下颌第一磨牙组织切片,通过免疫组织化学方法比较CK14和PCNA在正常小鼠与Vps4b基因敲除小鼠HERS中的表达情况。结果正常小鼠P5d开始形成HERS,PCNA在HERS细胞中强阳性表达;P9d,HERS结构连续,PCNA在HERS细胞中阳性表达;P11d,一小部分HERS开始断裂,PCNA在HERS细胞中弱阳性表达;P15d,HERS继续断裂,PCNA在牙根表面HERS细胞中弱阳性表达;P19d,牙根达到生理长度,PCNA仅在牙根末端HERS细胞中阳性表达。基因敲除小鼠与正常小鼠相比,P5d同样形成HERS结构,然而其断裂在P9d就开始出现,P19d牙根表面仅存少量HERS碎片,根尖发育不成熟,PCNA表达强度下降。结论Vps4b基因突变可能通过改变HERS中CK14和PCNA的表达,从而导致牙根发育异常。

猪轮状病毒vp4基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

本研究扩增猪轮状病毒中国分离株 JL94株VP4蛋白主要抗原编码区基因(1 756 bp),将测序结果与国外分离株进行比较;将该基因片段同载体pMel BacA连接后,与杆状病毒DNA共转染入昆虫细胞Sf9,经蚀斑筛选纯化重组病毒并再感染Sf9细胞获得 vp4 基因的表达,对表达的 VP4 蛋白进行 Western blot分析和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株VP4主要抗原编码区基因与国外分离株 CRW 8 株、Gottfried株该基因片段氨基酸同源性分别为96.43%和67%,说明 JL94株与 CRW 8 株属同一 VP4 血清型,而与 Gottfried株属不同血清型。JL94 株VP4主要抗原编码区氨基酸最大变异处位于 aa81 aa207。vp4 基因在昆虫细胞中表达量占细胞总蛋白的 20%,Western Blot证实表达蛋白有良好的生物学活性。所表达的蛋白免疫小鼠产生中和抗体,阻断 JL94 在 MA104 细胞上引起的细胞病变。

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒(RHDV)VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b(+)为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增了 816 bp的 VP4片段中抗原表位区。通过 T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒 p GEM- T上 ,转化至受体菌 DH5 α中。提取质粒经 PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒 p T- V4中含有轮状病毒的 VP4基因片段。经核苷酸序列分析 ,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原

鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究

目的 构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化。方法 抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC T载体 ,双酶切目的片断和植物表达载体 ,以T4连接酶将目的片断与载体相连接 ,电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果 成功地将目的基因定向克隆到表达载体 ,并转入到农杆菌中。结论 pUC T载体可直接进行PCR扩增产物克隆 ,便于测序 ;电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒 (>10kb)

鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株VP2基因的克隆和序列分析

以鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株（ＩＢＤＶＮＭ）ｄｓＲＮＡ为模板，用ＲＴＰＣＲ法扩增其主要寄主保护抗原ＶＰ２基因的全长ｃＤＮＡ，克隆于ｐＵＣ１９的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点，进行了全序列分析。序列比较发现ＩＢＤＶＮＭ毒株ＶＰ２基因与已报道的其它７个ＩＢＤＶＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２—７３、ＳＴＣ及ＶａｒｉａｎｔＥ毒株之间高度同源，其核苷酸序列的同源率为９１６％～９６．２％，推测的氨基酸序列的同源率为９６２％～９８．６％。ＩＢＤＶＮＭ毒株ＶＰ２高变异区的第一个亲水区氨基酸序列与ＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、ＳＴＣ、００２—７３比较，有一个氨基酸差异，第二个亲水区氨基酸序列与上述６个毒株完全相同。而与ＶａｒｉａｎｔＥ比较，两个亲水区内各有两个氨基酸差异。此外，ＩＢＤＶＮＭ毒株ＶＰ２具有强毒株所特有的７肽保守区：ＳＷＳＡＳＧＳ。这些结果表明，ＩＢＤＶＮＭ毒株为标准血清Ⅰ型ＩＢＤＶ强毒株。

口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达

用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem-t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)上,得到重组质粒pcDNA-VP1.根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1基因的主要抗原位点141位～160位及200位～213位的氨基酸序列,将F片段克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,得到重组质粒pcDNA-F.在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-VP1和pcDNA-F转染Vero细胞.间接免疫荧光分析表明VP1基因和F基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础.

O型口蹄疫病毒VP1嵌合基因的构建及原核表达

对O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原位点的研究表明,结构蛋白VP1～VP4均参与抗原位点的形成。但发挥主要作用的是VP1,该基因位于FMDV基因组的2977～3615位核苷酸,编码213个氨基酸。结构蛋白VP1功能区内包含FMDV的主要抗原位点,能诱导感染动物产生中和性抗体。它暴露于病毒颗粒的表面,易发生变异。在FMD研究中倍受关注。

口蹄疫病毒结构蛋白VP1生物信息学分析

VP1是组成口蹄疫病毒衣壳的重要蛋白,具有该病毒的主要抗原位点,其基因序列分析已被广泛用于分子流行病学调查研究。从GenBank数据库检索并下载我国上传的FMDV VP1基因序列36个,以贵州A型FMDV VP1为参考,对蛋白理化性质、二级结构、同源性等进行分析。结果显示VP1基因编码区长度为636bp,共编码212个氨基酸,含有α-螺旋、β-转角等丰富的二级结构。同源性分析表明我国FMDV VP1基因核苷酸相似性为50.3%~99.2%。

口蹄疫病毒基因组结构及其功能

口蹄疫病毒的基因组结构和功能是开展口蹄疫其他研究如鉴别诊断、新型疫苗研制和疫源追踪等工作的基础。口蹄疫病毒的基因组由5′UTR、ORF和3′UTR及Po ly(A)组成,全长约8 500 nt。VPg可能充当RNA合成引物的作用, 5′UTR 内的Poly(C)和内部核糖体进入位点(internalribosomaentrysite, IRES)是当前研究的热点之一。Poly(C)可能与病毒的感染性有关,IRES 对翻译的起始有重要作用。一般认为Poly(A)越长,病毒的感染性越强。病毒的ORF包括P1、P2、P3基因。L、P2、P3研究的相对较少,其中3A与病毒的宿主嗜性有关,3D为RNA聚合酶,可作为免疫和自然感染动物的鉴别诊断抗原。P1 为口蹄疫病毒的抗原结构,是研究口蹄疫免疫机制和新型疫苗的基础。VP1 可以作为分子流行病学调查,被很多国家所采用。

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段(vp73l)。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21(DE3),经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coliBL21(DE3)高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。

猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA,将猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D克隆到pET-28a(+)载体中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中进行表达。表达产物的分子质量为38ku,表达形式为包涵体。通过Western-blot证实,表达产物与猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体能够特异性结合。将重组蛋白经过8mol/L的尿素溶解后,作为间接ELISA的包被抗原,通过优化条件初步建立了检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA。该方法与纯化的猪传染性胃肠炎病毒包被的间接ELISA相比,符合率达到91.53%。本研究结果对大规模地推广应用猪传染性胃肠炎间接ELISA诊断方法具有重要意义。

深圳地区汉族献血人群MICA等位基因多态性及其与HLA-B基因的连锁不平衡分析

目的研究主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关基因A位点（major histocompatibility complex class Ⅰ chain-related geneA，MICA）在深圳地区汉族献血人群中的分布特点及其与人类白细胞抗原B位点（human leukocyte antigen locusB，HLA-B）基因的连锁不平衡关系。方法采用基于聚合酶链反应一碱基序列直接测序（PCR-sequence based typing，PCR-SBT）方法对143名随机深圳地区汉族献血者进行MICA和HLA-B基因高分辨分型，并采用Pypop软件分析等位基因频率、单倍型频率和连锁不平衡参数。结果143名献血者标本中共检出了13个MICA和35个HLA-B等位基因，其中MICA＊008：01频率最高（76／286）MICA＊008：01-HLA-B＊40：01和MICA＊010-HLA-B＊46：01是最常见的单倍型。结论获得了深圳地区汉族献血人群MICA和HLA-B基因的等位基因和单倍型多态性及连锁不平衡分析数据，列出了部分MICA和HLA-B等位基因及单倍型频率，为MICA和HLA-B基因的相关研究和应用提供了参考数据。

CTLA-4在重症肌无力患者中的表达及其多态性导致的无效转录研究

目的 探讨重症肌无力(MG)患者细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 -4 -(CTLA -4 )的表达状况及由CTLA -4基因启动区多态性导致的不同遗传易感性机制。方法 ELISA法测定MG患者血清中sCTLA 4的水平;限制性片段长度多态性分析用于检测启动区 1772、16 6 1位点的多态性;转录因子NF- 1和c -EBPβ结合位点通过染色质免疫沉淀实验(CHIP)得以验证。结果 MG患者血清sCTLA 4的表达水平与等位基因的突变相关,携带T→C -1 772 突变基因的患者可表达高水平的sCTLA -4。TC -1 772 基因型的频率在MG患者尤其是胸腺瘤亚组明显高于对照组,而G -1 6 6 1 等位基因和GG -1 6 6 1 基因型的频率在MG患者则显著降低。当 1772位点的等位基因是T而非C时,存在转录因子NF- 1结合位点;同样,当 16 6 1位点的等位基因是G而非A时,存在转录因子c -EBPβ结合位点,刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)能促进NF -1和c- EBPβ的这种位点特异性转录活性。结论 MG患者CTLA 4表达异常,启动区C T 1 772 和A G 1 6 6 1 多态性可导致无效转录,T→C 1 772 的突变能影响基因的剪接,干扰蛋白的表达和功能,阻止了负性调节信号的传递而致发病。