引起细胞病变的甲肝病毒BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因序列的测定

目的测定我室分离的甲型肝炎病毒(HAV)BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因区的核苷酸序列。方法从BJ-1感染的A549细胞中提取病毒RNA模板,通过RT-PCR扩增相应的cDNA片段,测定其核苷酸序列。结果BJ-1株与野型株MBB比较,VP4-VP2区有4个核苷酸变异,同源性为99.5％(731/735),推论的氨基酸序列有1个氨基酸变异,同源性为99.6％(244/245)。与HM-175比较,有30个核苷酸变异,同源性为95.9％(705/735),推论的氨基酸序列均相同,同源性为100％。结论核苷酸序列分析结果初步确定BJ-1株属甲型肝炎病毒。

基于5’UTR-VP4-VP2区测序鉴定手足口病肠道病毒

目前肠道病毒(Enterovirus,EV)分子分型主要基于VP1区,此区不仅可以分型还能区分亚型,但不同型别的肠道病毒在VP1区的核苷酸变异很大,需要使用多对引物或高简并度的简并引物进行巢式PCR才能定型,实验过程繁琐。本研究发现肠道病毒5’UTR-VP4-VP2区两端序列高度保守能利用通用引物进行扩增、中间序列差异大于10%能区分不同型别。本研究建立并验证5’UTR-VP4-VP2区测序鉴定手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)临床标本中肠道病毒的方法。根据ICTV公布的人肠道病毒104个型别的核苷酸全序列,在肠道病毒5’UTR-VP4-VP2区设计引物(EV543F/EV1197R)。收集702份肠道病毒核酸检测阳性的手足口病临床标本,用EV543F/EV1197R引物扩增5’UTR-VP4-VP2区基因并测序,BLAST比对定型;对407份标本同时进行RTPCR分型检测。在702份标本中鉴定出15个型别679份肠道病毒,阳性率为96.7%;407份RT-PCR分型结果和本法比较,结果显示EV-A71、CV-A16和CV-A10两法一致性很好(Kappa值0.966~0.970),本法CV-A6阳性率(38.82%)优于RT-PCR分型(34.40%),Mcnemar卡方P值=0.003。肠道病毒5’UTR-VP4-VP2区测序法具有较好的敏感性和简便、快速的特点,可用于手足口病肠道病毒感染的实验室诊断和相关研究。

甲型肝炎病毒VP4-VP2在昆虫细胞膜表面的表达

目的:利用杆状病毒表面展示系统将甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)的衣壳蛋白VP4-VP2展示在昆虫细胞膜表面,为甲型肝炎病毒的免疫检测奠定基础。方法:将HAV VP4-VP2基因片段插入杆状病毒膜蛋白基因gp64信号肽序列和水疱口膜炎病毒G蛋白跨膜区基因片段之间得到重组质粒pBac-sp-VP0-VSVtm。利用Bac-to-Bac系统获得含有该融合基因的重组病毒Ac-VP0-VSV。重组病毒感染昆虫Sf9细胞,免疫荧光分析目的蛋白在昆虫细胞的表达。结果:免疫荧光结果显示HAV VP4-VP2蛋白可在Sf9细胞的膜表面大量表达。结论:昆虫细胞膜表面展示系统构建成功,利用该系统HAV VP4-VP2蛋白可在昆虫细胞内表达并被展示到了细胞膜表面。

肠道病毒71型SHZH03株VP2和VP4基因的进化分析

目的:对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(中国台湾98年、日本99年及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的VP2和VP4基因进行了遗传进化分析.方法:在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA-STAR软件对VP2和VP4基因进行遗传进化分析.结果:SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的中国台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异.结论:中国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于中国台湾1998年EV71大规模流行时的毒株.

柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。

2021年南京市手足口病流行特征及柯萨奇A组4型VP1区基因特征分析

目的了解南京市手足口病(HFMD)流行特征,分析柯萨奇病毒A组(CVA)4型基因特征。方法收集2021年来自南京市12个区的监测样本,使用实时荧光定量PCR方法检测肠道病毒并分型,对排除CVA6、16、10型和肠道病毒(EV)71型阳性的其他未分型肠道病毒,用反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增VP4-VP2区,双向测序确定基因型,最后巢式扩增CVA4型的VP1区,确定其基因亚型。结果2021年南京市手足口病呈季节性流行,不同月份之间的肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=80.06,P<0.05)。易感人群为3~<6岁儿童,该年龄段阳性数占总阳性数的57.05%(178/312)。不同年龄段之间的肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=73.70,P<0.05)。地区分布中,肠道病毒阳性率占前三位的依次是玄武区94.74%(18/19)、浦口区94.00%(47/50)和江北新区83.33%(65/78),不同地区肠道病毒阳性率差异有统计学意义(χ^(2)=177.42,P<0.05)。550份标本中,荧光定量PCR法检测肠道病毒阳性312份,主要型别为CVA6型,占总阳性数的83.01%(259/312),其次依次为CVA16型(21份)和CVA10型(5份),未分型肠道病毒27份。经VP4-VP2区测序得到CVA4型6份,对其VP1区扩增测序后获得目的片段。结论南京市2021年手足口病主要型别以CVA6型为主,与其他毒株(CVA16型、CVA4型、CVA10型等)共同循环流行;其中CVA4型毒株均属于C2亚型,未发现新的亚型,需持续监测。

2011—2013年成都地区发热呼吸道症候群住院患儿鼻病毒流行病学特征

目的:监测分析2011—2013年成都地区发热呼吸道症候群住院患儿鼻病毒(HRV)检出情况、病原型别及流行特征,为本地区HRV感染防控提供基础数据。方法:应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对2011年1月—2013年12月从1 117例患儿鼻咽抽吸物标本提取的病毒核酸进行HRV-5′NCR筛检,随机挑取30例筛检阳性标本扩增HRV-VP4/VP2基因并测序,通过序列的比对分析鉴定病毒型别及变异状况。结果:1 117份鼻咽抽吸物标本中HRV-5′NCR核酸检出率为24.62%(275/1 117)。测序获得的30条HRVVP4/VP2中,HRV-A型15例,HRV-B型4例,HRV-C型11例。检出高峰在11月,1岁以内儿童检出率最高;不同临床诊断疾病中,伴有喘息性疾病的患儿中HRV检出率最高。结论:HRV是成都地区呼吸症候群住院患儿病毒性感染的常见病原,HRV感染在成都地区全年均可发生,不同季节和年龄组检出率不同,呈现多个基因型共同流行且以A型为主的特点。

基于VP4/VP2结合区基因序列对手足口病病原分型的初步研究

目的评估基于VP4/VP2结合区基因序列对手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病原分型方法的准确性,建立快速简易的手足口病病原分型方法。方法用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对2020年云南省曲靖市送检的49株已用VP1区基因序列分型的肠道病毒进行VP4/VP2结合区基因扩增并测序,获得VP4/VP2结合区分型结果。将VP4/VP2结合区基因分型结果与VP1区分型结果进行一致性评价,利用Mega 5.2软件对毒株基因组序列进行分析。结果49株肠道病毒经VP4/VP2结合区基因序列分型,共分出5个型别,包括肠道病毒(enterovirus,EV)-A组48株4个型别,EV-B组1株1个型别,未分离到EV-C、EV-D。与VP1区分型结果比较,EV-A、EV-B组病毒分型符合率100%,但EV-B组病毒只检测到1株。结论基于VP4/VP2结合区的手足口病病原分型方法对EV-A组病毒能准确分型,对EV-B、EV-C和EV-D组病毒的分型准确率有待积累更多病毒型别进一步研究。

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

2021年云南省手足口病病例中柯萨奇病毒A2型的测序定型和基因特征分析

目的对2021年云南省昆明市及曲靖市手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病例中非肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EVA71)和非柯萨奇病毒A组16型(coxsackie-virus A16,CVA16)的其他肠道病毒进行VP4/VP2区及VP1区基因测序检测,并对检测到的CVA2 VP1区基因进行基因进化分析,为CVA2的预防及控制提供实验室证据。方法按《手足口病实验室手册(2018年版)》,对2021年昆明市和曲靖市送到云南省疾病预防控制中心HFMD实验室的标本进行前处理,提取病毒RNA后,先用MD91/OL68-1引物扩增肠道病毒VP4/VP2结合区基因并测序,编辑后的序列在GenBank上搜索确定病毒型别,再用肠道病毒A组引物分两段扩增CVA2 VP1区基因完整序列并测序,通过肠道病毒在线定型工具(Enterovirus Genotyping tool Version 0.1)进行病毒型别确认。按文献下载CVA2 VP1区基因型/亚型代表株序列,Mega5.2软件构建基因进化树,分析病毒基因特征。结果共检测749份非EVA71和非CVA16的肠道病毒标本,两地皆以A组肠道病毒为主,B组肠道病毒有少量报告,CVA16居病原谱第一位。其中CVA25份,检出率为0.67%(5/749),为HFMD的稀有病原。VP4/VP2和VP1两个基因片段的测序检测、定型结果一致。基因特征分析表明,昆明市3株为基因型A,曲靖市2株为基因型D。结论2021年云南省HFMD监测网络中昆明市和曲靖市CVA2的检出率为0.67%,CVA2在这两个市是HFMD的稀有病原。基因进化分析表明,两个基因型分别在昆明市和曲靖市传播但尚未引起流行。昆明市CVA2基因型A为国内首次报道。加强云南省CVA2的实验室监测特别是分子流行病学监测,对追踪和分析病毒传染来源具有重要意义。

2021年宁夏回族自治区银川市流感样病例人鼻病毒感染情况及基因分型研究

目的了解2021年宁夏回族自治区银川市流感样病例人鼻病毒(HRV)感染情况及基因型别,为呼吸道感染有关疾病防治及控制提供依据。方法选取2021年1—12月银川市2家国家流感监测哨点医院具有呼吸道感染症状的鼻咽拭子样本,通过实时荧光定量反转录聚合酶链式反应法检测,对筛选的HRV阳性样本VP4/VP2区基因扩增测序,使用Mafft软件进行序列比对,MEGA 11.0软件构建亲缘关系进化树,DNA Star软件分析核苷酸和氨基酸同源性。结果1100份样本中,HRV的总检出率为8.00%(88/1100),其中单一HRV感染阳性率为7.64%(84/1100),合并其他病毒感染阳性率为0.36%(4/1100)。对扩增的57例VP4/VP2基因序列分析,其中A种40例、B种4例、C种13例,涉及28个血清型,A16血清型感染病例最多。HRV-A序列之间的核苷酸(氨基酸)同源性为73.10%~100.00%(78.40%~100.00%),HRV-B为78.50%~98.30%(89.20%~100.00%),HRV-C为68.90%~100.00%(76.10%~100.00%)。结论HRV是引起2021年银川市急性上呼吸道感染患者主要的病毒性病原之一,感染率较高,呈现以HRV-A感染为主,HRV-C次之的多个血清型共流行特点。