含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究

为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,血清RHDV HI效价为1∶16~1∶64,攻毒后免疫兔均健活(5/5);免疫后21 d,用Pm和Cp分别攻毒,免疫兔80%以上(4/5~5/5)保护;免疫持续期可达210 d。RHDV VP60蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗,解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题,同时实现了一针三防。

嵌合卵清蛋白-兔出血症VP60蛋白病毒样颗粒在杆状病毒表达系统中的表达及其鉴定

利用卵清蛋白(OVA)第257～264位氨基酸替换兔出血症病毒的主要结构蛋白质VP60不同位置处相应数量的氨基酸,研究了氨基酸的替换对VP60蛋白表达及病毒样颗粒装配的影响。通过重叠延伸剪接术(SOE)法,OVA T-细胞表位(257～264位氨基酸)分别取代VP60 3个区域(502～510位氨基酸、411～417位氨基酸、302～309位氨基酸),得到3种重组嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统,得到3种重组穿梭载体Bacmid,分别命名为Bacmid-V-1、Bacmid-V-2、Bacmid-V-3。将重组阳性质粒转染Sf9昆虫细胞,得到3种重组病毒rBac-v-1、rBac-v-2、rBac-v-3,3组重组病毒感染Sf9细胞后表达的3种蛋白质分别命名为Z1、Z2和Z3。经RT-PCR、IFA、SDS-PAGE、Western blot等方法鉴定后,利用电镜观察此3种重组蛋白质病毒样颗粒的形成情况。3种重组嵌合VP60蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达,3种重组嵌合蛋白质均可以形成与VP60蛋白类似的病毒样颗粒。

N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提供有利的参考和科学依据。

家蚕中猪细小病毒病毒样颗粒的制备

为了防控猪细小病毒(PPV)感染,本试验利用家蚕杆状病毒表达系统制备PPV病毒样颗粒(VLPs)。首先扩增PPV结构蛋白VP2基因,克隆至pFastBacⅠ载体中,构建转移载体pFastBacⅠ-VP2,将转移载体pFastBacⅠ-VP2转化大肠杆菌制备重组杆粒(Bacmid)。将Bacmid转染家蚕卵巢(BmN)细胞,制备重组杆状病毒。利用Western blot鉴定VP2蛋白的表达,采用透射电子显微镜观察PPV VLPs形态,血凝试验检测PPV VLPs的效价。将含有PPV VP2基因的重组杆状病毒注射家蚕幼虫制备PPV VLPs,并对家蚕中PPV VLPs进行鉴定。结果显示:BmN细胞样品和家蚕幼虫样品的Western blot检测,均可见64 kDa处存在VP2目的条带;在透射电子显微镜下可观察到约23 nm的PPV VLPs。BmN细胞中制备的PPV VLPs的血凝效价为1∶2~6,家蚕中制备的PPV VLPs的血凝效价为1∶2~9,其效价高于BmN细胞中制备的PPV VLPs效价。结果表明,本试验在家蚕中成功制备PPV VLPs,且具有良好的生物学活性,为PPV VLPs疫苗的研发提供了数据支持。

表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究

为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap^(169~180)-E2^(829~837))经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异。细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01)。体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性。综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础。

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

基于E2蛋白BVDV-1病毒样颗粒的构建及对小鼠的免疫效力评估

本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)E2病毒样颗粒(VLPs),并测定其对小鼠的免疫效力。选用BVDV-1 SWU-Z6株的E 2基因序列为模板,针对昆虫细胞密码子偏嗜性优化合成E 2基因,利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备BVDV-1 E2 VLPs。采用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot验证E2蛋白在SF9细胞中的表达,通过电镜鉴定BVDV-1 E2 VLPs的组装。对获得的VLPs进行超离纯化,使用不同剂量的VLPs添加MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂肌注免疫小鼠,同时设立BVDV商业灭活苗组和PBS空白对照组。二免4周后选用BVDV-1 SWU-Z6毒株以灌胃途径对小鼠进行攻毒,通过小鼠体重变化以及粪便中的病毒载量来评估BVDV-1 E2 VLPs的免疫保护效果。经酶切鉴定和测序验证表明,优化后的E 2基因已正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFast Dual中,并获得重组质粒pFast Dual BVDV-1 E2,将重组质粒转化到DH10.Bac感受态细胞经过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-BVDV-1 E2,将重组杆粒转染至SF9细胞,获得重组杆状病毒Baculo-BVDV-1 E2。电镜下观察可见大量直径在80~100 nm的BVDV病毒样颗粒,IFA和Western blot结果证实重组杆状病毒能够正确表达E2蛋白,并具有良好的生物学活性。BVDV-1 E2 VLPs 50μg组小鼠首免2周时ELSIA抗体效价约为1∶10000,加强免疫2周后抗体效价达到1∶100000。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠在攻毒后第7天表现出体重下降,而后开始回升;在攻毒后第10天采集粪便没有检测到病毒拷贝。与非免疫组小鼠相对比,BVDV-1 E2 VLPs 50μg剂量两次免疫后阻止了因病毒感染而导致体重下降以及消化道内病毒的复制。研究中成功制备了BVDV-1 E2 VLPs,能诱导机体产生较强的体液免疫反应,可使小鼠获得抵抗BVDV-1 SWU-Z6毒株感染的免疫保护力。

口蹄疫病毒VP1蛋白病毒样颗粒表达系统的构建

为制备Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）双层结构病毒样颗粒，选择牛病毒性腹泻病毒（BVDV）流行株BVDV JZ05-1核心蛋白p14的第169～270位氨基酸和 FMDV Asia 1/JS/CHA/05结构蛋白 VP1的第1～211位氨基酸，两者之间设计柔性肽连接，人工合成 p14-柔性肽-VP1融合蛋白编码序列，全基因长990 bp。合成基因与枯草芽胞杆菌表达载体 p7257-P43连接，构建成表达质粒 p7257-P43-P14-VP1。转化枯草芽胞杆菌 WB800，经筛选、鉴定，获得表达 p14-VP1融合蛋白的枯草芽胞杆菌。该重组表达菌在含有40μg/mL氯霉素的 LB中培养后，菌体超声破碎可检测到目的蛋白。Western blot 结果显示，该蛋白能特异性识别Asia 1型FMDV抗体，具有良好的反应原性。电镜观察显示，融合蛋白组装为直径约50 nm大小的病毒样颗粒（VLP）。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%～ 98% ,氨基酸同源性为 94%～ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。

昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。

兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析

以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区(西北、华东、东北、西南)的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3′端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3′端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析。结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒。通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3′端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3′端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒。

中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定

应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1株 ,在 1.0 m mol/ L IPTG和 37℃的条件下诱导 ,VP6 0 - GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western- blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的 870 0 0相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠 ,所得抗血清应用间接 EL ISA检测 ,与 RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明 ,大肠杆菌中表达的 RHDV VP6