牛传染性鼻气管炎病毒VP8蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的VP8蛋白抗原表位,本研究采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株针对IBRV的VP8蛋白的单克隆抗体(MAb),命名为1F5和3C2。MAb1F5和3C2的腹水效价均大于1:4×10~5,亚型均为IgG1/κ。间接免疫荧光试验表明,2株MAb与IBRV呈特异性反应。利用肽扫描技术对MAb进行抗原表位鉴定,结果表明MAb3C2的抗原表位为^(138)PHRSLLERTA^(147),MAb1F5的抗原表位为^(183)GGGQEPG^(189),2株MAb针对的抗原表位在不同的IBRV分离株中高度保守。本研究为VP8蛋白的结构与功能的进一步分析及IBRV的检测奠定了基础。

猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析

为了分析原核表达的猪轮状病毒（PRV）Gottfried株截短的VP8＊（△VP8＊aa64—223）重组蛋白的免疫原性，通过构建原核表达载体pET-28a—Gotffried—△VP8＊（aa64—223），转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导表达、经SDS—PAGE和Westernblotting检测，并纯化后，肌肉免疫Balb／c小鼠，证明重组蛋白相对分子质量约25．0kDa，以包涵体和可溶性两种形式存在，纯化的重组蛋白纯度在95％以上，可溶性蛋白产量可达14～15mg·L-1。ELISA方法检测表明该重组蛋白可以诱导高滴度的特异性抗体，证明其具有良好的免疫原性，为进一步研制PRV亚单位疫苗及建立ELISA诊断方法奠定基础。

P[1]型A群牛轮状病毒VP8重组蛋白的表达与免疫原性研究

【目的】利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA)VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1]VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17783和1∶64。【结论】本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。

兔轮状病毒VP8*蛋白原核表达、基因序列及蛋白特性分析

为深入研究兔轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能,本研究利用生物信息学软件DNAStar对兔轮状病毒Z3171株的VP8*基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析,运用生物信息学方法对该蛋白的理化性质、亲/疏水性、磷酸化及糖基化位点、结构域、中和表位及三维结构等进行了分析。设计合成引物,采用PCR方法扩增VP8*蛋白编码基因,并将目的片段克隆到pET28a(+)原核表达载体,经体外原核表达,采用亲和层析纯化获得VP8*目的蛋白。结果显示:Z3171株的VP8*基因与国内外参考序列对比,核苷酸序列同源性为32.8%~90.3%,氨基酸序列同源性为39.2%~91.9%。生物信息学分析显示该蛋白理化性质稳定,无跨膜结构域,不含有信号肽,主要定位于细胞骨架中。其中1个中和表位区域内有2个氨基酸插入,该区域三维构象亦发生变化。PCR扩增的VP8*基因条带大小为558 bp,经测序与目的基因完全一致;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,重组VP8*蛋白以可溶形式表达,血凝性试验结果表明该蛋白无血凝性。本研究为VP8*免疫原性分析及研制兔轮状病毒疫苗提供了参考。

牛传染性鼻气管炎病毒壳膜蛋白VP 8的原核表达及抗血清制备

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是牛传染性鼻气管炎的病原体,IBRV壳膜蛋白VP8在病毒复制及致病过程中发挥重要作用。本试验将表达IBRV VP8基因的重组表达质粒pET-32a-VP8转化入表达宿主Transetta(DE3)菌株内,采用37℃,IPTG浓度为1.0 mol/L诱导表达。将表达产物通过镍离子亲和层析纯化,将纯化的VP8融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。结果表明,重组蛋白VP8以包涵体的形式存在,其相对分子质量约110 kDa,Western Blot分析结果表明:该蛋白与抗IBRV的血清能发生特异性反应,以其所制备的抗血清与IBRV及病毒壳膜蛋白VP8特异性结合。结果表明,我们获得的IBRV VP8蛋白具备良好的免疫原性,所制备的抗血清将为研究IBRV致病机理提供科学依据。

Expression of PD1 and BTLA on the CD8^+T Cell and γδT Cell Subsets in Peripheral Blood of Non-Small Cell Lung Cancer Patients

Objective To investigate the expression and regulation of programmed cell death protein 1(PD1),B lymphocyte and T lymphocyte attenuator(BTLA)in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC);to examine the correlation of the mRNA levels between PD and BTLA in NSCLC.Methods Flow cytometry was used to detect the expression of PD1 and BTLA on the surfaces of CD8^+T cells andγδ+T cells in the peripheral blood samples collected from 32 in-patients with stage IV NSCLC and 30 healthy individuals.We compared the expression of PD1 and BTLA on the surfaces ofγδ+T cells in the NSCLC patients with bone metastasis before and after the treatment of zoledronic acid.The correlations of PD1 and BTLA,as well as their ligands were analyzed using Pearson correlation analysis with the cBioPortal data platform.Results The frequency of PD1 on the surfaces of CD8^+T cells was significantly higher than that of theγδT cells in both healthy controls(t=2.324,P=0.024)and NSCLC patients(t=2.498,P=0.015).The frequency of PD1 on CD8^+T cells,rather than onγδ+T cells,was significantly upregulated in advanced NSCLC patients compared with that in healthy controls(t=4.829,P<0.001).The PD1+BTLA+γδT cells of the healthy controls were significantly lower than that of the NSCLC patients(t=2.422,P=0.0185).No differences in percentage of PD1+γδ+and BTLA+γδ+T cells were observed in 7 NSCLC patients with bone metastasis before and after zoledronic acid treatment.PD1 was positively correlated with BTLA in both lung adenocarcinoma(r=0.54;P<0.05)and lung squamous cell carcinoma(r=0.78;P<0.05).Conclusions The upregulation of co-inhibitory molecules occurs on the surfaces of both CD8^+T cells andγδT cells in advanced NSCLC,suggesting that these molecules were involved in regulating the inactivation of CD8^+T cells andγδ+T cells,immune escape and tumor invasion.

破伤风毒素T细胞表位P2对猪轮状病毒△VP8^＊蛋白免疫原性的增强作用

仔猪轮状病毒腹泻严重危害养猪业，为了开发亚单位疫苗，本课题组前期构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的VP8^＊蛋白（△VP8^＊，64～223位氨基酸）原核表达载体pET28a—SB1A△VP8^＊。为了进一步提高亚单位疫苗的免疫原性，将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白，构建重组载体pET28a—P2-SB-IA△VP8^＊。P2-S13-1A△VP8^＊和S13-1A△VP8^＊在大肠杆菌中表达并纯化。重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫Balb／c小鼠，利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示：P2-S13-1A△VP8^＊和S昏1A△VP8^＊在大肠杆菌中得到了高水平、可溶性表达；重组蛋白P2-SB-1A△VP8^＊诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8^＊，说明P2可以增强SB-1A△VP8^＊的免疫原性，为日后开发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。

猪源P[6]型轮状病毒GST-VP8^*-Z84蛋白的表达及受体结合特征

目的通过基因工程技术表达我国猪源P[6]基因型轮状病毒(rotaviruses,RVs)GST-VP8*-Z84蛋白,研究该蛋白与寡糖、唾液受体的结合特征。方法以猪源P[6]型RV Z84为研究对象,利用GST大肠杆菌表达系统及亲和层析、凝胶过滤层析法纯化得到病毒GST-VP8^*-Z84蛋白,通过ELISA唾液结合实验及寡糖结合实验分析该基因型与唾液及寡糖受体的结合特征。结果猪源P[6] GST-VP8^*-Z84蛋白与黏蛋白核心2具有很好的结合。结论P[6] RV的潜在受体可能是黏蛋白核心,为轮状病毒与受体间的作用机制及研发RV疫苗和高效治疗药物提供实验基础与理论依据。

牛UK株轮状病毒VP8蛋白多拷贝嵌合表位的免疫原性分析

轮状病毒VP8＊蛋白由纤突蛋白VP4裂解形成,VP8＊蛋白决定了VP4蛋白血清特异性中和反应相关,本试验原核表达UK株牛轮状病毒VP8＊多拷贝嵌合肽段,纯化并比较分析其免疫原性。首先根据GenBank上发表的牛轮状病毒UK株VP8＊蛋白的编码序列及可能的主要抗原表位区（aa 1~11和aa 218~235）,设计并合成引物,以扩增这两个区段的嵌合基因,克隆到原核表达载体pET-28α（＋）上,并通过酶切位点连接构建嵌合基因的3拷贝重复重组表达载体,同时构建单拷贝和全长VP8＊表达载体。重组载体转化到E.coli感受态细胞中,IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot证实重组蛋白大小与预期相符且能与His-tag单抗发生特异性反应;ELISA结果表明免疫后3拷贝蛋白较单拷贝蛋白血清抗体水平更高。本试验确定了原核表达的3拷贝嵌合VP8＊重组蛋白免疫后具有良好的抗原性,为今后抗轮状病毒疫苗的研制及抗轮状病毒药物的发展提供参考。

P[14]型轮状病毒VP8蛋白特异结合A型组织血型抗原

目的 研究轮状病毒与组织血型抗原之间的关系。方法以直接从人粪便标本中检测到的比较少见的G8P[14]型轮状病毒为研究对象，表达纯化得到P[14]VP8蛋白，通过寡糖结合和唾液结合实验，研究其与组织血型抗原的结合。结果P[14]VP8蛋白可以与A型寡糖和A型唾液特异结合，而没有检测到与其他型别的组织血型抗原结合。结论A型组织血型抗原可能是P[14]型轮状病毒的潜在受体，这为进一步研究其他型别轮状病毒受体结合特征及轮状病毒监测提供了一定的基础和依据。

P[4]、P[6]和P[8]型轮状病毒VP8*核心区蛋白的表达和纯化

为进一步深入研究我国人群中轮状病毒主要流行的P[4]、P[6]和P[8]型毒株的受体结合特点及结构基础,本研究将P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区(VP8*core)基因分别构建到原核表达载体pGEX4T-1和pET30a中,利用大肠杆菌表达获得轮状病毒P[4]、P[6]和P[8]型毒株VP8*核心区蛋白,并通过亲和层析分别纯化得到VP8*core-GST融合蛋白和VP8*-his标签蛋白,SDS-PAGE显示蛋白大小分别为46kDa和20kDa。综上,本研究成功构建了pGEX4T-1-VP8*core和pET30a-VP8*core重组质粒,利用原核表达系统得到VP8*coreGST融合蛋白和VP8*core-his蛋白,为VP8*蛋白的功能和结构研究提供基础。

猪轮状病毒核酸免疫的研究

将昆明鼠随机分为A、B两组,分别肌肉注射含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA＿VP7和真核表达载体pcDNA3 1(+),每只鼠100μg/100μL,共免疫3次,每次间隔2周。首次免疫第0、14、21、28、35、39、47、54d采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞的数量变化。A组小鼠血清在首免后第14d即可检出阳性抗体(P/N≥2 0)。A组与B组小鼠外周血CD4+、CD8+T细胞数量在首免后第14d开始有显著差异(P<0 05)。

轮状病毒疫苗株VP8＊核心区蛋白的表达和纯化

目的为了研究轮状病毒疫苗株VP8t蛋白的功能和结构特征，利用原核表达系统纯化得到VP8}核心区蛋白（VP8＊core，64．223位氨基酸）。方法从口服疫苗中提取兰州疫苗株LLR病毒核酸，RT—PCR得到目的片段，克隆到pET30a载体中构建重组质粒。根据已合成的Rotateq和RotarixPf8]VP8$全长基因，PCR得到VP8{核心区片段，克隆到pET30a载体构建重组质粒。重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）进行蛋白表达。利用Histrap HP和superdex200纯化柱，通过亲和层析和分子筛层析纯化得到目的蛋白。结果VP8s核心区蛋白以可溶形式表达，并通过纯化得到较纯的VP8fcore蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS—PAGE）显示相对分子质量约为20kDa。结论成功构建了pET30a—VP8＋core重组质粒，得到轮状病毒各疫苗株VP8score蛋白，为研究疫苗株受体结合特征以及疫苗评价提供了基础和参考。

重组轮状病毒疫苗VP8~*蛋白与组织血型抗原的结合性研究

目的评价轮状病毒(Rotaviruses,RVs)疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白与组织血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)基因融合的免疫效果。方法从GenBank获取Rotarix和RotaTeq两种疫苗VP8^*蛋白基因序列,根据大肠埃希菌常用密码子进行序列优化后人工合成Rotarix和RotaTeqVP8^*蛋白基因并采用PCR扩增合成的两种基因,引物上、下游分别引入Nde I和Xho I限制性内切酶酶切位点。将PCR产物及载体pET-30a用Nde I和Xho I双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后在T4连接酶作用下连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞并进行PCR鉴定,取阳性菌液提取质粒,经Nde I和Xho I双酶切鉴定正确后测序。将合成的基因序列与表达载体pET-30a连接后导入大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG诱导表达,经Ni2+beads亲和层析纯化得到VP8*-His融合蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析。利用寡糖结合试验检测目的蛋白与lea、lex、leb、ley、A、B、H1、H2 8种寡糖的结合特性,利用唾液结合试验检测VP8*蛋白与不同血型组织抗原表型唾液的结合特征。结果成功构建重组质粒,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为26×103,与预期的分子质量相符合。寡糖结合试验显示Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白能与H1型HBGAs结合,唾液结合试验显示二者能与分泌型唾液结合而不与非分泌型唾液结合。结论成功克隆表达了轮状病毒疫苗株Rotarix和RotaTeq VP8^*蛋白,两种蛋白均有与H1型HBGAs结合的特性。

轮状病毒Rotateq及Rotarix疫苗VP8~*蛋白的原核表达、纯化与鉴定

目的 :通过大肠埃希菌原核表达体系,分别获得轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的VP8*基因表达产物,为深入研究轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能奠定基础。方法 :基因合成轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的P[8]型VP8*基因序列,将其克隆到携带有GST标签的pGEX-4T1表达载体中构建重组质粒pGEX-4T1-VP8*,测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),通过SDS-PAGE电泳检测表达产物,并通过Glutathione Sepharose 4B纯化柱进行纯化,Western Blot鉴定。结果 :SDS-PAGE电泳结果显示分子量52KD处有深染带,Western-Blot显示该处蛋白能与GST标签抗体结合。结论 :成功构建了包含Rotateq及Rotarix VP8*基因的重组表达载体pGEX-4T1-VP8*,获得了可溶性GST-VP8*重组蛋白。

马源P[12]型轮状病毒GST-VP8*-E403蛋白的表达及受体结合特征

目的通过研究中国马源P[12]型轮状病毒GST-VP8*-HorseP[12]E403蛋白与寡糖、唾液受体的结合特征,进而为轮状病毒的跨种传播及受体间的作用机制提供重要科学依据。方法通过大肠杆菌表达系统表达、纯化中国马源P[12]型轮状病毒GST-VP8*-Horse P[12]E403蛋白,并利用唾液及寡糖结合实验分析该基因型的受体结合特征。结果马源GST-VP8*-Horse P[12]E403蛋白与黏蛋白核心mucin core 2糖结合良好,与A、B、Lewis型等寡糖及唾液中的HBGAs均不结合。结论VP8*-Horse P[12]E403蛋白的潜在受体可能是黏蛋白核心2,未与人唾液发生结合。

A组轮状病毒疫苗株LLR VP8＊基因的原核表达及纯化

目的 表达A组轮状病毒疫苗株LLR的VP8＊蛋白,为深入研究LLR的功能特性奠定基础.方法 从兰州生物制品所生产的A组轮状病毒疫苗中提取病毒RNA为模板,经过RT-PCR反应获得轮状病毒LLR株VP8＊基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T1表达载体中构建重组质粒pGEX-4T1-VP8＊,测序正确后转化大肠埃希菌BL21（DE3）,通过SDS-PAGE电泳、免疫印迹方法检测IPTG诱导表达后的产物,用Glutathione Sepharose 4B纯化目的蛋白.结果 SDS-PAGE电泳可见大小约为52 000的融合蛋白,Western-Blot显示该蛋白能与GST标签抗体结合.结论 成功构建了包含LLR株VP8＊序列的重组表达载体pGEX-4T1-VP8＊,获得了可溶性GST-VP8＊重组蛋白.

猪轮状病毒NJ2012株VP8基因序列分析及原核表达

为深入研究猪轮状病毒VP8蛋白的结构和功能,以及研制新型猪轮状病毒疫苗,利用生物信息学软件DNAStar对本研究室保存的1株A组G9P7型猪轮状病毒NJ2012的VP8基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法扩增VP8蛋白编码基因,用限制性核酸内切酶对目的片段与pET28a(+)原核表达载体进行双酶切,构建了重组原核表达载体,用IPTG诱导表达,并进行Western blot验证。结果显示:NJ2012毒株的VP8基因序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%~99.2%,氨基酸同源性为42.1%~97.5%;VP8基因克隆成功,经测序与目的基因完全一致;经鉴定,构建的重组原核表达质粒pET28a-VP8能够在DE3宿主菌中表达,该蛋白以包涵体形式存在;Western blot结果显示该蛋白可与抗His-tag鼠单克隆抗体发生特异性反应。本研究实现了VP8蛋白在原核系统中稳定表达,为调查该蛋白的免疫原性及研制安全、高效的猪轮状病毒亚单位疫苗提供了参考。

A组P[15]型牛轮状病毒VP8*蛋白多糖结合特异性研究

目的研究A组P[15]型轮状病毒VP8*蛋白的多糖结合特异性。方法利用大肠杆菌表达系统制备A组P[15]型牛轮状病毒毒株的VP8*蛋白,通过寡糖结合实验、生物膜层干涉实验及血凝等方法研究其与不同糖的结合。结果A组P[15]型牛轮状病毒VP8*蛋白结合Neu5Ac和Neu5Gc唾液酸,与α2,3和α2,6方式连接的唾液酸糖也有较好的结合。此外,P[15]VP8*蛋白可以凝集人和动物的红细胞。结论唾液酸可能是A组P[15]型轮状病毒的糖受体。与猴P[3]、猪P[7]轮状病毒相似,牛P[15]VP8*蛋白与唾液酸结合,并且序列和结构分析显示它们具有相同的糖结合位点。

轮状病毒P[6]基因型毒株LL4260株的VP8＊核心区蛋白的表达和纯化

目的为研究P[6]基因型轮状病毒受体结合特性，利用原核表达纯化得到P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株的VP8＊核心区蛋白。方法将P[6]基因型毒株LL4 260株的质粒利用PCR扩增得到核心区基因片段，克隆到pET30a载体中构建重组质粒pET30a-LL4260VP8＊core，重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中进行蛋白表达，经亲和层析和分子筛层析纯化表达后得到目的蛋白。结果P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株核心区pET30 a-LL4260VP8＊core蛋白为可溶表达，经纯化及电泳鉴定，得到相对分子质量为22×103的目的蛋白。结论本研究构建的P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株pET30 a-LL4260VP8＊core重组质粒，表达纯化了相应核心区目的蛋白，为进一步分析蛋白的性能和结构提供基础。