VPAC2在CHO细胞的表达及鉴定

PAC2是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)和血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)的共同受体,介导多种重要生物学功能。为获得稳定特异表达VPAC2的中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞,将pcDNA-VPAC2表达载体转染CHO细胞,G418筛选转染阳性克隆,PACAP38标准品诱导阳性克隆细胞的胞内cAMP生成,筛选出对PACAP38最为敏感的阳性单克隆细胞株(VPAC2-CHO),运用RT-PCR、Westernblot和免疫荧光法检测VPAC2受体表达情况,利用VPAC2受体特异激动剂通过竞争性结合试验和促进胞内第二信使cAMP生成的活性检测实验证实,VPAC2-CHO特异表达有功能的VPAC2。Scatchard作图分析显示VPAC2-CHO的VPAC2受体密度为(1.1±0.2)pmol/mg膜蛋白,PACAP38与VPAC2的解离常数Kd值为(0.55±0.10)nmol/L。特异表达VPAC2受体细胞系的构建为深入研究该受体理化性质、生物学功能以及筛选、开发VPAC2受体新型特异激动剂和拮抗剂等研究奠定了基础。

新型重组VPAC2激动剂RD的制备及促进胰岛素功能的分子机制

利用DNA重组、原核表达、Chitin-Beads柱和HPLC纯化、质谱鉴定等技术,制备了一种新型具有抗2型糖尿病功能的VPAC2受体激动剂RD,并初步研究和揭示了其在Ⅱ型糖尿病治疗中有效促进胰岛素信号传导的分子机制。实验结果表明:利用基因重组技术制备的VPAC2受体激动剂RD的分子量为3 785.0 Da,纯度为96%;将重组肽作用于正常或胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞(IR模型细胞),1和5μmol/L重组肽RD可促进正常3T3-L1脂肪细胞IRS-1蛋白的表达(分别增加36%和42%),而促进IR模型细胞IRS-1蛋白的表达增加更为明显(分别增加55%和63%)。IR模型细胞经1,5和10μmol/L重组肽RD处理后,p IRS1(ser307)的表达水平分别比降低了5.9%,10.7%和32.7%。在IR模型细胞中,5和10μmol/L RD处理组,IRS-2蛋白的表达水平分别降低12.8%和40.6%;而1,5和10μmol/L RD各处理组p IRS2蛋白的表达水平分别降低35.1%,40.8%和48.5%。5 and 10μmol/L RD处理的IR模型细胞中Akt蛋白的表达显著增强,表达量分别增加74%和77%。1,5和10μmol/L的重组肽RD处理的IR模型细胞中,Akt Ser473磷酸化水平分别降低33.9%,64.0%和71.1%;Akt Thr308磷酸化水平分别升高13.5%,78.6%和83.3%。建立了重组VPAC2受体激动剂RD的制备技术,并在体外细胞水平检测了其效果(显著促进正常3T3-L1脂肪细胞及IR模型细胞IRS-1蛋白的表达;降低IR模型细胞p IRS1(ser307),IRS-2,p IRS2蛋白的表达;促进IR模型细胞Akt蛋白的表达及Akt Thr308磷酸化水平等),为阐明其在2型糖尿病治疗中的分子作用机制及药用研发提供了实验基础。

新型抗2-型糖尿病基因重组RMBAY的克隆、表达及生产环节优化

利用基因重组方法构建RMBAY的原核表达载体pKY-BAY,并研究其生产的优化条件。选用大肠杆菌偏爱密码子,用PCR方法合成全长RMBAY多肽基因,并定向插入到高效表达载体pKYB-mcs中,用大肠杆菌ER2566进行表达,融合蛋白经Chitin-Beads柱纯化后,结合在柱上的融合蛋白用β-巯基乙醇诱导蛋白内含肽的N端自动切割,释放目的肽,目的肽由质谱鉴定。实验结果表明:利用载体pKY-B在大肠杆菌ER2566中,RMBAY能够实现高效表达;在优化的生产条件下,RMBAY的产量可达到6.7mg/L发酵产物,纯度大于98%,质谱鉴定RMBAY的分子量为3.887kDa.与理论值相符合。

左归丸联合温和灸调节骨质疏松症模型大鼠OPG/RANKL轴的作用研究

目的:观察左归丸联合温和灸对骨质疏松症模型大鼠OPG/RANKL轴的影响。方法:雌性SD大鼠48只,随机分为对照组、模型组、左归丸组、左归丸+温和灸组,每组12只。除对照组外,其余大鼠采用手术完整摘除双侧卵巢法进行造模,对照组仅开腹后缝合,饲养3个月后每组大鼠随机取1只作病理组织学观察判断造模成功。左归丸组予左归丸灌胃,左归丸+温和灸组予左归丸灌胃+"长强穴"艾灸治疗,对照组和模型组予0.9%氯化钠溶液灌胃。治疗90d后,骨密度测定观察大鼠股骨近端及第2腰椎骨密度变化,RT-PCR检测大鼠骨组织VPAC2、OPG和RANKL mRNA的表达水平。结果:(1)与对照组比较,各组大鼠平均股骨近端密度、第2腰椎骨密度均显著减少(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,左归丸组、左归丸+温和灸组大鼠平均股骨近端密度、第2腰椎骨密度均显著增加(P<0.05,P<0.01);与左归丸组比较,左归丸+温和灸组大鼠平均股骨近端密度、第2腰椎骨密度均增加(P<0.05)。(2)与对照组比较,模型组大鼠骨组织VPAC2 mRNA、RANKL mRNA表达显著上调,OPG mRNA表达显著下调,OPG/RANKL比值显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,左归丸组、左归丸+温和灸组VPAC2 mRNA、RANKL mRNA显著下调,OPG mRNA表达显著上调,OPG/RANKL比值显著升高(P<0.05,P<0.01);与左归丸组比较,左归丸+温和灸组大鼠骨组织OPG mRNA表达显著上调,RANKL mRNA表达显著下调,OPG/RANKL比值显著升高(P<0.05)。结论:左归丸联合温和灸对骨质疏松症模型大鼠的骨密度下降具有一定的改善作用,能通过上调OPG mRNA,下调大鼠骨组织VPAC2、RANKL mRNA的表达,达到治疗骨质疏松症的目标。

重组PACAP衍生物RMBYLL的高效制备及其体外生物学效应

为了利用基因工程技术高效制备具有治疗Ⅱ型糖尿病功能的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生物RMBYLL,并在体外研究其生物学效应,采用基因重组技术表达重组肽RMBYLL,纯化、制备并鉴定重组肽RMBYLL后,利用特定细胞系和Western-blot等技术,检测RMBYLL对VPAC1、VPAC2和PAC1受体的选择性和激动活性,以及重组肽RMBYLL对胰岛素受体介导的信号传导最终效应物—葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的影响。实验结果表明:利用重组肽技术制备的RMBYLL的M_r为3.901k,纯度大于95%,其产率为18.7 mg/(L发酵产物);制备的RMBYLL可与VPAC2受体特异结合并显著促进VPAC2-CHO细胞cAMP的产生,其受体半激活浓度(EC_(50))为0.90 nmol/L,目的肽RMBYLL可显著增强3T3-L1脂肪细胞GLUT4的表达,阳性实验组是对照组的1.91倍。由此表明,利用本研究确立的表达、纯化策略可实现高活性RMBYLL的高效制备,应用前期构建的含有特定受体的CHO细胞和3T3-L1脂肪细胞模型,可方便有效地进行相关药物肽的体外生物学效应研究。