VSV-G假型反转录病毒载体在基因治疗中的应用

VSV- G假型反转录病毒是一种新型的基因转移载体 ,具有滴度高 ,宿主范围广 ,抗补体灭活等优点。离体及活体基因转移研究表明 ,VSV- G假型病毒能够有效地将外源基因转移到多种靶细胞中 ,并获得稳定的转基因表达。本文就近年来 ,VSV- G假型病毒在造血细胞 ,免疫细胞 ,肝细胞 ,以及神经元细胞介导的基因治疗中的应用情况作简要综述 ,并展望其未来的发展前景。

VSV-G假型反转录病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在新生血友病B小鼠中的有效转移和表达

研究探索了 ＶＳＶ－Ｇ假型反转录病毒 ｉｎ ｖｉｖｏ途径基因治疗血友病Ｂ的可行性．采用新型包装细胞 系 ２９３－ＧＰＧ制备了 ＶＳＶ－Ｇ／ＧＩＮａＢＡⅨ假型病毒，该病毒的最高滴度可达 ８．５ × １０～８ ＣＦＵ· ｍＬ～（－１），与传 统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应（Ｐ＜０．００１），并初步证实了新生鼠血清补体对ＶＳＶ－Ｇ假 病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体（Ｐ＜０．０１）．不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病Ｂ 鼠后，各治疗组小鼠血浆均可持续检测到 ｈＦⅨ抗原，最高峰值为（７２．５±６．１） ｎｇ·ｍＬ～（－１），表达持续超过 １２０ ｄ．治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善，以大剂量治疗组的改善最为明显，凝血活性提高 至（３．４± １．５）％， ＡＰＴＴ时间缩短至（４３．６± ７．２）ｓ． ｈＦⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂 量呈正相关．治疗小鼠体内未检测到抗ｈＦⅨ抗体，未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因 转移．研究结果表明，采用 ＶＳＶ－Ｇ假型反转录病毒开展新生血友病 Ｂ 小鼠 ｉｎ ｖｉｖｏ基因治疗是可供选择 的有效方法．

含人反意N-ras cDNA顺序的假型逆转录病毒的电镜观察

本文应用透射电镜观察了经含人反意(antisense)N-ras cDNA顺序的假型逆转录病毒(pseudo-type retrovirus)转染,首次上清感染、多轮上清感染的人鼠双嗜性(amphotropic)辅助细胞PA317和小鼠单嗜性(ecotropic)辅助细胞φ2,在细胞中均见有该逆转录病毒存在。多轮上清液感染的细胞中所观察到的病毒颗粒数多于首轮感染的细胞。其结果与上清液中病毒滴度提高的结果一致。对照组细胞中未见有病毒颗粒存在。

应用反转录聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ ＮＤＶ） 和鸽Ⅰ型副粘病毒Ｆ 基因的保守序列，设计合成１ 对引物ＸＺ９ 、ＸＺ１０ ，用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ） 对３ 株鸽Ⅰ型副粘病毒和６ 种其它禽病原体进行检测。结果，该引物对３ 株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ 产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴＰＣＲ 最低能检出１ ｐｇ 的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。

实时荧光反转录聚合酶链式反应检测甲型H1N1流感病毒RNA

目的 快速准确检测甲型H1N1流感病毒,提高流感亚型鉴别诊断水平.方法 采用实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time FQ RT-PCR）检测385例流感患者鼻咽拭子标本和血浆H1N1-RNA.结果 68例患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性率为17.66%,治疗第3、5、7天后甲型H1N1流感患者鼻咽拭子甲型H1N1-RNA阳性阴转率分别为20.51%、66.67%和91.02%,鼻、咽拭子标本检测H1N1-RNA有差异（P〈0.01）,血浆H1N1-RNA检出1例阳性.结论 real-time FQ RT-PCRneng能快速准确检测甲型H1N1流感病毒核酸,有利于早期治疗和疫情控制.

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型多重反转录-聚合酶链反应的建立及初步应用

本文旨在建立一种快速、高效的检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)的方法,用于儿童手足口病的病原学监测。通过设计肠道病毒通用引物和CA16、EV71的型特异性引物,建立以不同引物浓度配比及两阶段退火温度提高检测敏感度和特异度的多重反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对首都儿科研究所附属儿童医院2010年3～10月收集的371例手足口病患儿381份临床标本同时进行病毒分离和核酸检测。结果显示,本研究建立的多重RT-PCR方法对CA16和EV71的最低模板检测浓度分别为5.32pg/ml和0.64pg/ml,反应特异度为100%。应用该方法检测381份手足口病临床标本的总阳性率为77.4%,其中CA16与EV71的检测阳性率分别为31.8%和35.4%,两者检测阳性比为1∶1.1。以病毒分离为标准,多重RT-PCR对CA16及EV71检测的准确率分别为95.2%和98.6%。因此,本研究新建立的多重RT-PCR方法准确、简便,适用于较大量样本的手足口病病原学监测。2010年引起北京地区儿童手足口病的主要病原为CA16和EV71。

假型逆转录病毒载体高效介导兔平滑肌细胞基因转染

目的构建假型逆转录病毒载体MuLV／VSV-G，并用于转染兔平滑肌细胞，为兔平滑肌细胞基因转染寻找一种高效的载体。方法构建含有报道基因lacZ的假型逆转录病毒载体MuLV／VSV—G，测定滴度，并转染兔平滑肌细胞，观察其转导效率。并与MuLV的转导效率进行比较。结果构建的MuLV／VSV-G载体，病毒滴度为6～7．8×10^6CFU，转染兔平滑肌细胞的效率是（92±12）％。而MuLV的转导效率为（24土5）％。结论成功构建了假型逆转录病毒载体MuLV／VSV-G载体，该载体作为一种高效的载体可用于兔平滑肌细胞基因转染。

假型逆转录病毒载体介导的tPA转染对平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨假型逆转录病毒载体VSV-G/MuLV介导组织纤溶酶原激活物(tPA),lacZ基因转染兔平滑肌细胞(SMCs)后基因的表达和对SMCs增殖的效应.方法:利用携带tPA,lacZ基因的假型逆转录病毒载体VSV-G/MuLV分别转染兔SMCs(SMCs/tPA,SMCs/lacZ).通过检测tPA抗原和测定tPA的活性观察tPA基因的表达.通过x-gal染色检测β-gal的活性测定lacZ基因的表达.用放射性标记的脱氧胸腺嘧啶苷(3H-TdR)掺入法和细胞计数法测定SMCs的增殖.结果:在没有纤溶酶原时,SMCs/tPA与SMCs在增殖上无显著差异.在有纤溶酶原时,SMCs/tPA条件培养基诱导了SMCs增殖.结论:VSV-G/MuLV介导tPA,lacZ转染到SMCs并成功表达.tPA基因转染在纤溶酶原存在的条件下促进了SMCs的增殖.

基因Ⅵ型新城疫病毒反转录数字PCR检测方法的建立与应用

基因Ⅵ型新城疫病毒(NDV)是导致我国当前鸽新城疫流行的主要基因型。国家新城疫参考实验室监测数据表明,鸽NDV分离率近年来有上升趋势。为了实现基因Ⅵ型NDV快速检测和精确定量,针对国内流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了反转录数字PCR(RT-dPCR)方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,建立的RT-dPCR方法线性关系良好,灵敏度高,最低检测限为1.97 copies/μL;特异性强,与其他基因型NDV强毒株和常见禽病病毒无交叉反应;重复性好,变异系数为2.2%。利用本方法对临床采集的180份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测,检测结果与病毒分离结果一致。以上结果表明,本研究建立的RT-dPCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于基因Ⅵ型NDV的快速检测和精准定量,同时也为基因Ⅵ型NDV核酸标准物质研制奠定了基础。

人类免疫缺陷病毒1型慢性感染者B细胞表型分析及抗反转录病毒治疗的修复作用

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染会造成严重的免疫功能损伤,除引起CD4+T细胞不断耗损和功能损伤外,体液免疫应答也受到损伤。本研究通过检测HIV-1慢性感染者和慢性感染治疗者外周血B细胞数目和亚群比例,以及活化、凋亡和共刺激分子的表达,探讨HIV-1感染者中B细胞损伤及抗反转录病毒治疗(ART)对B细胞损伤的修复作用。结果显示,HIV-1慢性感染者外周血B细胞数目显著低于健康对照组,其中未成熟B细胞、初始B细胞、静息记忆B细胞和浆母细胞显著降低,而组织样记忆B细胞显著增加,ART可恢复初始B细胞和组织样记忆B细胞比例,但不能恢复静息记忆B细胞比例。与健康对照组相比,HIV-1感染者未成熟B细胞、初始B细胞、静息记忆B细胞和组织样记忆B细胞中CD38的表达上调;CD95的表达在所有B细胞亚群中均上调;而Bcl-2在初始B细胞、组织样记忆B细胞和浆母细胞中的表达显著降低;静息记忆B细胞和浆母细胞中PD-1的表达上调;共刺激分子CD40在所有B细胞亚群中的表达降低,而CD70的表达在未成熟B细胞以外的亚群中均显著下调。ART仅能部分修复以上分子的表达。结果表明,HIV-1感染引起B细胞及其亚群比例异常,B细胞表现为过度活化、易凋亡及与T细胞作用受损,ART不能完全修复B细胞损伤,有效的免疫干预策略亟待开发。

假型逆转录病毒高效介导人乳腺癌细胞基因转移

目的 :探索假型逆转录病毒MuLV/VSV G在乳腺癌细胞基因转导的效率 ,为乳腺癌细胞基因转导找寻一种高效的载体。方法 :将含报道基因的假型逆转录病毒MuLV/VSV G转导入人乳腺癌MDA MB 435细胞 ,观察其转导效率 ,并与MuLV的转导效率进行比较。结果 :MuLV/VSV G的转导效率达 (92± 12 ) % ,MuLV的转导效率为 (2 4±5 ) % ,前者较MuLV转导效率提高 3.8倍。结论 :假型逆转录病毒MuLV/VSV G可作为一种高效的载体广泛应用于乳腺癌的基因治疗研究。

反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。

复合探针实时荧光RT-PCR法检测小儿上呼吸道感染甲型流感病毒的价值

目的 分析小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测的临床价值。方法选择2023年1月至2023年12月流感监测信息系统两家监测点上呼吸道感染甲型流感病毒感染的患儿80例监测标本进行回顾性分析,均开展复合探针实时荧光RT-PCR法检测,分析其诊断价值。结果 根据监测标本最终诊断结果显示,阳性标本68例、阴性标本12例。经复合探针实时荧光RT-PCR法检出67例,检出率为83.75%,敏感度为95.59%、特异度为83.33%、准确度为93.75%、阳性结果预测值为97.01%、阴性结果预测值为76.92%;批间批内变异系数均小于5%。结论 小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光RT-PCR技术具有较高的敏感度、特异度及准确度,且检查结果快速,可为小儿上呼吸道感染甲型流感病变提供可靠的诊断,有利于制订合理的治疗方案。

应用多重反转录PCR技术检测病毒性呼吸道感染

目的为了寻求呼吸道感染病毒的快速诊断并指导治疗,建立一种多重反转录PCR体系。方法分别设计针对肠病毒、腺病毒、乙型流感病毒和甲型流感病毒标准株的特异性引物,采用多重反转录PCR检测4种病毒。结果应用此多重反转录PCR系统可以特异的同时检测到同一模板中的肠病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。通过用多重反转录PCR和单一PCR对36份临床标本的检测相比较,结果表明多重反转录PCR的检测与单一PCR的检测结果是一致的。结论通过与单一的PCR对比,证明该多重反转录PCR系统可替代单一的PCR用于肠病毒、腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的呼吸道感染的快速诊断。

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果：PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论：实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒（PERV）的抑制作用奠定了基础。

广州地区扎幌样病毒的检出及基因型分析

目的了解广州腹泻儿童是否存在扎幌样病毒(Sapporo-like virus,SLV)感染。方法在2003年秋冬季腹泻流行期间在南方医院儿科收集临床诊断为病毒性腹泻患儿的粪便标本,并采用半套式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测。纯化阳性标本PCR产物并测序,然后将其同GenBank中的参比毒株序列比较。结果收集的169份标本中有1份SLV(CH03354)PCR扩增阳性,检出率为0.59%,同源性分析表明该毒株属于SLV GⅠ-1群。结论广州地区存在SLV所致感染,本次实验检出毒株基因型与安徽毒株不同,说明我国不同地区可能存在不同的SLV基因型。

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。

流行性乙型脑炎病毒一步法RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时间短,灵敏度比常规RT-PCR方法高,可检测出103TCID50/0.2mL JEV;特异性强,对猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等常见猪病毒均无交叉反应。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测流行性JEV的方法。

松毛虫质型多角体病毒RT-PCR检测技术的建立

为研究DsCPV在松毛虫种群中的垂直传递及对松毛虫灾害的持续控制作用 ,通过反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)建立了DsCPV的早期检测技术。依据家蚕质型多角体病毒 (BmCPV)质型多角体蛋白的核苷酸序列设计一对引物 ,从纯化的DsCPV、BmCPV和舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)的基因组dsRNA可成功地扩增出长 6 14bp的目的片段 ,从提取的健康松毛虫幼虫肠组织的DNA、舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)基因组核酸、以及棉铃虫质型多角体病毒 (HaCPV)基因组核酸 ,未能扩增出目的片段。DsCPV基因组dsRNA扩增片段的序列与BmCPV相应基因序列具有 87%的同源性 ,检测敏感度为 1pg的DsCPV基因组dsRNA。由于松毛虫与家蚕、舞毒蛾相互之间食性不同 ,而且BmCPV和LdCPV对松毛虫无感染性 ,即在松毛虫体内不会有Bm CPV病毒和LdCPV病毒的感染 ,因此该结果一方面从分子水平上证实了DsCPV与BmCPV、LdCPV存在基因同源性 ,同时也表明了依据BmCPV的基因序列设计引物对DsCPV基因组核酸建立的RT PCR扩增体系 ,可以作为松毛虫种群中DsCPV的一种敏感、特异、早期、快速的检测手段。

RT-PCR-RFLP方法鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒

建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT-PCR-RFLP方法。通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM-E区域部分基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶SpeⅠ消化后于15g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并利用建立的RT-PCR-RFLP方法对78份临床样品进行了JEV的检测及基因型鉴定。结果显示,特异性引物可扩增出长为819bp的片段,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性。经SpeⅠ酶切,基因Ⅰ型JEV RT-PCR产物被切为568和251bp 2个条带,基因Ⅲ型JEV RT-PCR产物被切为446、251和122bp 3个条带,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV混合RT-PCR产物被切为568、446、251和122bp 4个条带,该方法最低可检出1.5pg·μL-1的JEV RNA。RT-PCR-RFLP结果显示78份临床样品中有14份为JEV阳性,其中6份为基因Ⅰ型,8份为基因Ⅲ型,与核苷酸测序分析结果一致。本研究为日本脑炎病毒的实验室诊断及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别提供了一种快速有效的分子生物学方法。