HPLC-VWD-ELSD法同时测定消炎宁胶囊中7个成分的含量

目的 采用高效液相色谱-紫外检测器-蒸发光散射检测器(HPLC-VWD-ELSD)法同时测定消炎宁胶囊中苦玄参苷IA、异嗪皮啶、迷迭香酸、金丝桃苷、甘草苷、冬青素A和毛冬青皂苷A1的含量。方法 采用Waters Symmetry C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为乙腈(A)-0.15%醋酸水溶液(B),梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1)。苦玄参苷IA、异嗪皮啶、迷迭香酸、金丝桃苷、甘草苷采用VWD进行检测,切换波长分别为270 nm及342 nm;冬青素A和毛冬青皂苷A1采用ELSD进行检测,漂移管温度为85℃,载气流速3.5 L·min^(-1)。结果 苦玄参苷IA、异嗪皮啶、迷迭香酸、金丝桃苷、甘草苷、冬青素A和毛冬青皂苷A1进样量分别在1.764~35.28μg、0.6903~13.81μg、0.9524~19.05μg、0.4067~8.134μg、0.2136~4.272μg、0.9182~18.36μg和0.7665~15.33μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r≥0.9991),平均回收率及RSD分别为100.01%(0.81%)、99.14%(0.84%)、99.40%(0.92%)、99.34%(1.02%)、99.20%(1.04%)、98.83%(1.09%)、98.99%(1.08%)。4批消炎宁胶囊中上述7个成分的含量测定结果分别为6.812~6.901 mg·g^(-1)、1.726~1.789 mg·g^(-1)、2.391~2.422 mg·g^(-1)、1.134~1.155 mg·g^(-1)、0.6087~0.6105 mg·g^(-1)、2.306~2.324 mg·g^(-1)和1.995~2.016 mg·g^(-1)。结论 所建立的方法简捷,重复性好,可用于消炎宁胶囊中7个成分的含量测定,为消炎宁胶囊全面的质量控制提供科学依据。

HPLC-VWD-Q-TOF-MS/MS法定性与定量分析枳实栀子豉汤成分

目的采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法快速鉴定枳实栀子豉汤化学成分和HPLC-VWD法同时测定枳实栀子豉汤中的6种成分。方法采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术,在正、负离子模式下分别定性分析,借助PeakView分析软件,比对部分标准品,同时参考相关文献,分析推断枳实栀子豉汤中的化学成分。采用HPLC-VWD法同时定量枳实栀子豉汤的6种成分(京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)。结果从中共鉴定出38个化合物,包括枳实15个化合物、栀子14个化合物、淡豆豉10个化合物,1个化合物为栀子与淡豆豉共有。6种成分在各自范围内线性关系良好(r>0.9990);加样回收率98.44%~101.32%;RSD 0.47%~1.68%。结论该方法稳定可靠,可用于枳实栀子豉汤的质量控制。

HPLC-VWD法测定猪粪中喹乙醇的残留

建立了猪粪中喹乙醇残留的高效液相色谱检测方法，猪粪经蒸馏水提取震荡后，加入硼砂和硫酸锌等净化剂净化样品，离心，过0．22μm滤膜，HPLC检测，以ZORBAXSB—C18色谱柱为固定相，12％甲醇水溶液为流动相，在波长382nm状态下进行检测。喹乙醇浓度为0．05—10．0μg／ml时与色谱峰面积呈线性关系，绝对系数R^2=0．9999。在0．6—3．0mg／kg浓度添加范围内，回收率为70．07％-83．44％，日内变异系数为1．20％-4．38％，日间变异系数为4．64％-9．62％，样品的检出限为0．4μg／kg。

菊黄东方鲀卵黄蛋白原肽段vWD的真核重组表达及功能研究

河鲀的卵黄蛋白原可能参与河豚毒素(TTX)的体内转运过程。为了探讨该机理,建立了毕赤酵母真核表达系统,成功地表达了菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)卵黄蛋白原的vWD结构域肽段(rTF_(v)WD),并采用Biacore-表面等离子体共振(SPR)系统检测了rTF_(v)WD与TTX的亲和力,以及腹腔注射小鼠验证rTF_vWD对TTX毒力的中和作用。结果表明:rTF_(v)WD与TTX的平衡解离常数(KD)为3.1 mmol/L;将TTX与rTF_vWD共孵后肌肉注射小鼠,2 h内小鼠的死亡率显著下降,表明TTX与rTF_(v)WD结合后,TTX的毒性降低了。

vWD家系基因连锁分析的应用研究

目的 探讨 v WF基因内含子 4 0中 nt1890 - 1990和 nt2 2 15 - 2 380两个四核苷酸 STR位点的扩增长度片段多态性 (am p- FL P)在血管性血友病 (v WD)基因诊断和遗传咨询中的应用。方法 对 8个家系中的相关成员v WF基因内含子 4 0中两个 STR位点进行聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)与银染技术对 PCR产物进行检测 ,通过两位点的 am p- FL P进行基因连锁分析。结果 8个家系 v WF基因内含子 4 0中nt1890 - 1990位点和 nt2 2 15 - 2 380位点各检出 5种等位基因 ,均有效确定出与致病基因连锁的单倍型组成 ,结合临床症状 ,为遗传咨询提供了线索。结论 v WF基因内含子 4 0的两个四核苷酸重复位点是进行家系间接基因诊断较好的遗传标记 ;PCR- PAGE能方便、快速与准确地检测 v WF基因内含子 4 0的两个 STR位点的片段长度多态性 ,适用于 v WD的家系分析和遗传咨询。

红螯螯虾卵黄蛋白原VWD结构域的原核表达及纯化

【目的】原核表达红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)卵黄蛋白原(Vg)VWD结构域,为深入开展Vg的生物学功能研究和开发相应的生物活性物质提供技术支持,也为改进虾类养殖催熟及获取高质量后代打下基础。【方法】在GenBank中搜索红螯螯虾卵Vg的mRNA序列(AF306784.1)及查找其VWD结构域(2345~2491 aa),采用ExPASy ProtParam、ProtScale、InterProscan及TMHMM等在线软件进行生物信息学分析及理论评估,结合大肠杆菌密码子偏好优化原始VWD氨基酸序列;然后通过全基因合成获得目的基因,连接至载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-VWD,挑取阳性克隆转化大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞及采用IPTG进行诱导表达,并以10%SDS-PAGE电泳和Western blotting检测诱导表达的融合蛋白。【结果】红螯螯虾VWD结构域相对分子量为19692.11 Da,理论等电点(pI)为9.35,分子式为C855H1334N258O261S9,属于不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域。延伸链和无规则卷曲是红螯螯虾VWD结构域二级结构的主要元件,其中,α-螺旋占7.73%,β-转角占10.50%,延伸链占35.91%,无规则卷曲占45.86%。重组质粒pET-28a-VWD经大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞诱导表达即获得融合蛋白VWD,以2 mol/L盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析纯化及复性后,10%SDS-PAGE电泳和Western blotting检测均在蛋白相对分子量约20.0 kD处出现1条清晰的特异性条带,融合蛋白VWD表达形式以包涵体为主。融合蛋白VWD在BL21(λDE3)感受态细胞中高效表达的最佳诱导条件:当单克隆菌液OD600 nm达0.6时添加0.5 mmol/L IPTG,置于20℃下诱导培养16 h。纯化后的融合蛋白VWD浓度为1.32 mg/mL。【结论】通过全基因合成获得的优化红螯螯虾VWD基因能在大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞中诱导表达出以包涵体为主要形式的融合蛋白,经盐酸胍溶解和Ni-NTA亲和层析柱纯化及复性即可获得高纯度的活性VWD蛋白,为后续开展红螯螯虾Vg生物学功能研究及开发相应的生物活性物质提供技术支持。

一个重症vWD家系临床与基因分析

目的：研究重症血管性血友病（ｖＷＤ）患者家系成员临床表型特征，并分析血管性血友病因子（ｖＷＦ）基因缺陷的传递规律。方法：应用ｖＷＦ多聚体分析和ＥＬＩＳＡ法检测重症ｖＷＤ患者父母家系四代２６位成员临床表型。在此基础上针对ｖＷＦ基因内多个ＲＦＬＰ和ＶＮＴＲ位点，对所有家系成员进行缺陷基因遗传分析。结果：患者血浆ｖＷＦ∶Ａｇ＜２％，检测不到多聚体条带。基因分析表明两条ｖＷＦ等位基因分别来自父方和母方家系，且均有缺陷。部分家系成员携有一条缺陷基因，ｖＷＦ水平正常或有轻度下降，多聚体图谱正常。结论：①先证者可能为复合杂合子型的３型ｖＷＤ患者，携带者的缺陷基因可被正常基因弥补。②应用ｖＷＦ基因多种多态性标志行ＤＮＡ分析对重症ｖＷＤ家系遗传咨询有实用意义。

VWD-A型沉降计在地铁基坑开挖墙后土体沉降与墙体侧移的响应研究

基坑墙后地表沉降S与围护结构的变形D密切相关,但其定量关系尚不明确。研究确定S-D的定量关系后,可以通过围护结构的侧移来预测墙后地表的沉降。本文采用数值模拟及参数分析的方法,建立了59个三维有限元数值模型,研究了不同地铁基坑几何参数,并在实际工程应用中采用VWD-A型振弦式土体沉降计进行了地表沉降测量,并与模拟分析数据进行了对比,结果表明基于所建立的S-D定量关系预测的墙后地表沉降和实测值吻合度较高。

HPLC-VWD-ELSD法同时测定黄甲软肝颗粒中6个成分的含量

目的:采用高效液相色谱-紫外检测器-蒸发光散射检测器(HPLC-VWD-ELSD)法同时测定黄甲软肝颗粒中没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷R_(1)、黄芪甲苷和丹参酮Ⅱ_(A)的含量。方法:采用Waters Symmetry C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇(A)-0.1%醋酸水溶液(B),梯度洗脱,流速为1.0 m L·min^(-1)。没食子酸、葛根素和丹参酮Ⅱ_(A)采用VWD进行检测,检测波长为270 nm;芍药苷,三七皂苷R_(1)和黄芪甲苷采用ELSD进行检测,漂移管温度为70℃,载气流速2.0 L·min^(-1)。结果:没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷R_(1)、黄芪甲苷和丹参酮Ⅱ_(A)进样量分别在1.444-28.88、2.118-42.36、1.074-21.48、0.2180-4.360、0.1151-2.302和0.06670-1.334μg范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)分别为93.8%、98.8%、97.5%、103.0%、100.6%和96.6%,RSD分别为1.4%、0.55%、3.3%、4.0%、3.9%和2.3%。5批黄甲软肝颗粒中上述6个成分的含量测定结果分别为2.612-3.203、9.155-10.342、7.044-9.863、0.622-0.841、1.529-1.697和0.719-0.957 mg·g^(-1)。结论:所建立的方法简便、快捷,重复性好,可用于黄甲软肝颗粒中6个成分的含量测定,为黄甲软肝颗粒全面的质量控制提供科学依据。

随钻钻柱振动声波技术对塔北地区风化壳的识别

随钻钻柱振动声波技术(Vibro-acoustic While Drilling-VWD)自2010年在塔里木盆地塔北地区应用以来,已经录取完成了近30口井的任务,对岩性和地层界面的识别有了较深的认识,取得了一定的研究成果和重大突破。特别是振动声波频谱图的变化规律在多井风化壳界面的识别上有很好的对应关系。通过对钻柱振动声波谱图的分析研究发现:VWD谱图能有效地识别风化壳地层,岩性变化主要反映在谱图的主频、频率分布、频矩曲线以及谱图颜色上。

鸡排泄物中金霉素残留的测定方法研究

为研究建立抗生素药物残留的环境生态风险性评估提供方法,建立了鸡排泄物中金霉素残留高效液相色谱分析方法。鸡排泄物经复合提取液均质提取后,调节溶液pH后,离心过滤,以ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相,用0.01 mol/L乙二酸、甲醇、乙腈按77∶11.5∶11.5体积比混合溶液为流动相,在375 nm波长状态下进行HPLC检测。金霉素浓度在0.1-10.0μg/mL之间,其标准曲线呈线性相关,相关系数r2=0.999 8,在0.5-10.0 mg/kg浓度添加范围内,回收率71.46%-98.01%,日内变异系数0.89%-4.72%,日间变异系数1.94%-7.94%,检出限0.05 mg/kg。

血管性血友病因子在ABO血型个体中质和量差异的实验研究

目的比较血管性血友病因子在ABO血型中质和量的差异。方法运用ELISA法同时测定A血型、B血型、AB血型及O血型四组正常人的vWF抗原水平(vWF:Ag)、VWF瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:Rcof)及vWF胶原结合试验(vWF:CBA),并应用统计方法比较不同血型之间结果的差异。结果O型血个体其vWF:Ag、vWF:Rcof及vWF:CBA均低于非O型血,差异有显著统计学意义(P<0.001);同时,vWF:CBA下降水平大于vWF:Rcof,使得vWF:CBA/Ag(P<0.001)小于vWF:Rcof/Ag(P值为0.84)。结论O型血较非O型血个体有更高的出血危险,在临床诊断vWD的过程中要充分考虑ABO血型系统对血浆vWF水平的影响。

1例并发Ⅰ型血管性血友病的华氏巨球蛋白血症病例报道

患者,男,59岁,因“反复皮肤黏膜出血3年余”就诊。患者曾有外力导致鼻腔出血难以自行止血病史。行凝血相关检查,初步诊断为Ⅰ型血管性血友病(von Willebrand disease,vWD)。进一步完善实验室及相关检查,患者免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)增高明显,确诊为华氏巨球蛋白血症;同时检测出髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MYD88)的L265P突变合并趋化因子C-X-C基元受体4(chemokine C-X-C motif receptor 4,CXCR4)基因变异,位点为c.1013C>G。积极治疗原发病后,未再次出血。vWD是一种少见的获得性出血疾病,大多数病例是由于循环中的抑制物诱发血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)清除加速所致;华氏巨球蛋白血症等B淋巴细胞疾病,其循环中IgM可能加速vWF的清除,从而继发vWD。MYD88^(L265P)与CXCR4^(1013G)双突变的华氏巨球蛋白血症肿瘤负荷重,IgM高,更易并发vWD。该病例资料提示医务人员在诊断vWD时应警惕是否存在其他原发病;治疗的同时对于免疫球蛋白增高的相关B淋巴细胞疾病,特别是MYD88^(L265P)与CXCR4^(1013G)双突变的华氏巨球蛋白血症,应早期干预,避免诱发vWD,从而减轻患者出血症状,提高其生存质量。

高效液相色谱法同时测定水中的9种酚类化合物

建立了高效液相色谱法同时测定水中的9种酚类化合物的分析方法。水样经固相萃取法处理后,以HypersilODS色谱柱(250mm×4.6mmi.d,5μm)为分离柱,(甲醇+乙酸)/(水+乙酸)为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0mL/min,柱温为35℃,采用VWD检测器检测,9种酚类化合物的检出限均在0.00010mg/L以下,加标回收率在85%～130%之间。方法简便,适用于水中酚类化合物的分析。

高效液相色谱-紫外检测器法测定化妆品中的苯甲醇

建立了高效液相色谱-紫外检测器法检测化妆品中苯甲醇含量的方法。样品用甲醇超声提取20 min,离心、过滤,用Agilent ZORBAX ODS分析柱分离分析,紫外检测器检测,外标法定量。苯甲醇在0.0464～0.464 mg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.99992。添加水平为46.40～92.80 mg/L的回收率为82.3%～118.4%,测定结果的相对标准偏差为0.14%(n=6),检出限(S/N=3)为0.10 mg/kg。结果表明,该方法能满足化妆品中苯甲醇含量的检测。

化妆品中6-甲基香豆素的高效液相色谱-紫外检测器法测定

建立了高效液相色谱-紫外检测器法测定化妆品中6-甲基香豆素含量的方法。样品通过甲醇超声提取20 min,离心、过滤,Agilent ZORBAX300SB-C18(4.6×250 mm,5μm)分析柱分离分析,紫外检测器检测,外标法定量。方法在0.101 9～10.19μg/mL范围内线性关系良好,相关系数(r)=0.999 99,回收率在94.67%～103.15%之间,相对标准偏差(RSD)小于3%,检出限(S/N=3)为0.05 mg/kg,定量限(S/N=10)为0.10 mg/kg。采用该方法测定了15种化妆品中6-甲基香豆素的含量,结果满意,可以满足实验室日常检测工作的需要。

2个血管性血友病家系的临床表型和基因型分析

目的探讨2个血管性血友病(von Willebrand Disease,VWD)家系的临床表型与血小板膜糖蛋白GP1BA(platelet glycoprotein Ib alpha,GPⅠba)、血管性血友病因子(von Willebrand factor,v WF)第28个外显子、血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13基因变异情况。探索血管性血友病家系的发病机制。方法对4例临床诊断为血管性血友病家系的患者的外周血进行全基因组DNA提取,参照CCDS数据库人类基因序列设计PCR引物,以基因组DNA为模板对GP1BA、v WF28、ADAMTS13基因进行PCR扩增后采用凝胶电泳观察产物是否合格并进行基因测序。结果在一个家系中发现GP1BA基因G1206A(E429K)突变位点,同时检出一父子存在39个碱基缺失但不是VNTR序列,且发现该患儿母亲GP 1BA存在VNTR B/C杂合子。检测到v WF 28多态性位点G4039A(SNP位点)、A4391G(T1381A)、G4664C(D1472H)、T4891C(SNP位点);2个家系的ADAMTS13基因均未发现突变位点。结论 (1)在v WF28上发现多态性位点G4039A(SNP位点)、A4391G(T1381A)、G4664C(D1472H)、T4891C(SNP位点),可能与家系1(2B型血管性血友病)的发病有关。(2)在家系2中,患者的GP1BA基因上检测到一个新的突变位点G1206A(E429K),可能与患者患有血小板型血管性血友病有关。(3)本研究还发现在家系2中患者及患者的父亲GP1BA基因均存在一段39个碱基的缺失,但并不是串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeats,VNTR)片段。且患者的母亲存在VNTR B/C杂合子。可能是促进该患者发病的重要因素。

自动固相萃取-高效液相色谱-紫外检测法测定肉和肉制品中的三聚氰胺残留

用Venusil ASB-C18(4.6×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为庚烷基磺酸钠∶乙腈(pH3.2)=90∶10(体积比),流速为1.0 mL/min,检测波长240 nm的色谱条件下,经提取处理并经混合型阳离子交换柱固相萃取净化,对肉及肉制品中的三聚氰胺残留进行测定,结果表明在0.5μg^100.0μg之间有较好的线性关系r,=0.999 6。回收率在87%~94%,RSD为3.8%~4.2%(n=6)。