HA基因侧翼重组痘苗病毒的生物学特性研究

以痘苗病毒ＨＡ基因为侧翼，在多种类型痘病毒）启动子的下游，插入ＨＩＶ－１的ｇａｇ基因及其上游序列、或ＨＩＶ－１ｇａｇ－ｅｎｖ嵌合基因、或狂犬病病毒的糖蛋白基因，从而构建了１２株重组痘苗病毒。统计发现，以ＨＡ基因为侧翼构建重组病毒的重组率约为０．１％，与ＴＫ基因为侧翼的重组率差别不大，但阳性重组率有很大差别，从２．７％到１００％。试验观察发现，ＨＡ基因为侧翼的重组病毒具有以下生物学特性：（１）感染性稍低于野生型病毒；（２）能够稳定地表达外源蛋白；（３）可引起细胞融合。根据重组病毒能引起细胞融合的特性，改进了重组病毒的筛选方法。

痘苗病毒天坛株非必需区与病毒生物学性状的关系

将位于痘苗病毒启动子p25下游的lαc基因插入到5个非必需区中,用X-gal筛选获得表达β-半乳糖苷酶的相应重组病毒。Southern印迹杂交证实,lαc基因准确地插入到相应的非必需区中。5株重组病毒与天坛野毒株的生物学性状比较表明,M片段SphⅠ位点插入lαc基因对重组病毒在兔子皮内毒力和小鼠脑内毒力没有明显影响,重组病毒的宿主范围和温度稳定性与亲本株相似,lαc基因能够稳定遗传和表达;K片段左起第一个BglⅡ位点插入lαc基因后,病毒在兔子皮内和小鼠脑内毒力均下降1～2个对数,但宿主范围和温度稳定性没有改变,lαc基因能稳定遗传并表达;K片段左起第三、四个BglⅡ及K/F交界处的HindⅡ位点插入lαc基因对病毒毒力亦无明显影响。这些结果说明M片段sphⅠ位点、K片段左起第三、四个BglⅡ位点及K/F交界处HindⅢ位点适合于外源基因表达和基因工程疫苗研究。

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究，该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中；（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子；（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ，在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高，在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上，对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白，从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白茎区居间序列突变株的拯救及其生物学特性的分析

为了探究新城疫病毒(NDV)HN蛋白茎区居间序列氨基酸突变对其蛋白及病毒生物学特性的影响,利用overlapping PCR分别扩增包含E91A和S92A突变的HN基因,并将突变引入真核表达质粒pCAGGS及NDV全长cDNA中。通过红细胞吸附试验、神经氨酸酶试验等分析突变对蛋白功能的影响;并通过反向遗传操作技术拯救突变病毒,分析突变对病毒生物学特性的影响。结果显示,E91A突变能显著增强HN蛋白的红细胞吸附活性,同时显著降低神经氨酸酶活性;而S92A突变则导致蛋白的红细胞吸附活性及促融合功能显著下降;并且2个突变均会显著削弱病毒的复制能力,在一定程度上降低病毒毒力,影响其组织嗜性。研究结果表明,HN茎区居间序列的E91和S92氨基酸突变对蛋白及病毒的生物学特性具有重要影响,可作为减毒疫苗株改造及小分子药物设计的靶标位点。