VEGF165基因表达载体的构建和鉴定

目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础。方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定。结果:完成真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞(吸光度值0.345±0.064)与空载体转染(吸光度值0.114±0.012)的对照比较,有显著的VEGF165表达(P<0.01),SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达。结论:应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。