Vasostatin基因重组腺病毒载体的构建及其对胰腺癌生长的抑制作用

目的 以复制缺陷型腺病毒为载体 ,构建vasostatin基因重组腺病毒 ,并观察其对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 以人肌肉cDNA文库为模板应用PCR的方法扩增出vasostatin的DNA片断 ,定向插入腺病毒穿梭质粒 pshuttle CMV经酶切、测序鉴定正确后 ,电穿孔法将重组穿梭质粒转化E .coliBJ5 183 AdEasy 1感受态细菌 ,行细菌内同源重组。将抗性筛选和酶切鉴定正确的重组质粒 pAd CMV vasostatin转染 2 93细胞进行包装。病毒扩增纯化后 ,病毒感染人胰腺癌细胞 ,RT PCR和Western印迹法检测vasostatin的表达状况。复制人胰腺癌裸鼠移植瘤模型 ,瘤内注射 10 7pfupAd CMV vasostatin、10 8pfupAd CMV LacZ及PBS ,观察移植瘤的生长曲线及瘤重。 结果 PCR产物电泳后可见长度为 5 6 0bp左右的目的条带 ;酶切及测序鉴定表明穿梭质粒 pshuttle CMV中插入了vasostatin的DNA片断 ;卡那霉素抗性筛选及PacI酶切鉴定证实腺病毒重组质粒 pAd CMV vasostatin构建成功 ;转染 2 93细胞 7天后观察到细胞病理学效应出现。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有vasostatin片断。RT PCR和Western印迹法证实vasostatinmRNA及蛋白的表达。治疗后 3周 pAd CMV vasostatin组移植瘤的体积及瘤重均显著小于 pAd CMV LacZ组及PBS组。

人血管抑制因子Vasostatin短片段(120-180 aa)的克隆、表达及功能研究

目的:利用基因工程技术,克隆并表达人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区片段,探讨其对鸡胚绒毛尿囊膜新 生血管抑制的作用。方法:采用PCR技术扩增人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区基因,并利用pQE30原核表达系统诱 导表达Vasostatin120-180aa,经镍金属螯合层析法纯化,通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证其抑制新生血管生成的作用。结果:PCR 扩增出了长度为180 bp的Vasostatin120-180aa功能区基因,后经pQE30原核表达系统表达并纯化出Vasostatin120-180aa,SDS-PAGE 显现一条约8 kD的阳性条带,Vasostatin120-180aa可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成。结论:原核表达的Vasosta- tin120-180aa功能区片段具有生物学活性,可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成,在一定范围内呈量效依赖性。

人vasostatin的克隆、表达、纯化及活性检测

从成人肝脏cDNA文库中 ,PCR扩增得到人vasostatin基因编码区序列 ,将此序列插入原核表达载体pQE3 0进行表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)测定表明产物以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白量的 5 0 %以上 .包涵体洗涤后溶于 8mol/L尿素溶液 ,在变性条件下通过镍 氨三乙酸 (Ni NTA)金属螯合亲和层析柱进行纯化后 ,再经透析进行复性 .N端氨基酸序列、分子质量、等电点等理化指标的测定结果与理论值相符 .用内皮细胞增殖试验、内皮细胞迁移试验以及鸡胚尿囊膜血管生成试验等方法进行活性检测 ,证实复性的表达产物具有抑制内皮细胞增殖和迁移。

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用。方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-Vasostatin(MO I分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P<0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以MO I为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。

人嗜铬粒蛋白AN-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达

目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。

Vasostatin重组腺病毒的构建和体外表达的研究

目的 构建 vasostatin重组腺病毒表达载体 ,并进行体外表达研究。方法 根据 Gen Bank中提供的钙网蛋白序列 ,设计并合成引物 ,以人骨骼肌 c DNA文库为模板用 PCR扩增出人 vasostatin基因 ,将其克隆入 T载体。经酶切及测序鉴定后亚克隆至穿梭载体 ,与经过限制酶处理的骨架腺病毒载体 DNA- TPC复合物共转染 2 93细胞。用 Western blot检测体外表达。结果 PCR扩增出约 5 90 bp产物 ,测序结果与文献报道一致。用 PCR及Western blot证实重组腺病毒构建成功 ,能有效的表达出 vasostatin蛋白。结论 vasostatin重组腺病毒载体能有效的在体外表达出

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。

酵母双杂交技术筛查与vasostatin相互作用的蛋白质

目的:通过酵母双杂交技术筛查与血管生长抑制因子vasostatin相互作用的蛋白质,为进一步阐明其抑制血管生成作用的分子机制奠定基础。方法:应用第3代酵母双杂交系统,构建vasostatin诱饵质粒,经过表达和自激活验证后筛选预转化的人内皮细胞cDNA方库。将在四缺培养基中筛选得到的阳性克隆提取酵母质粒转化大肠杆菌,进行限制性酶切和测序,寻找可能与vastotatin具有相互作用的蛋白序列。结果:经过酵母双杂交共获得21个克隆,经过验证,有3个阳性克隆;经过NCBI的BIAST进行同源性分析,它们的核酸和蛋白序列与已知基因高度同源,它们分别为层黏连蛋白α5(7547～8112)和整合素αV(1257～1820、316～878)片段,均为重要的配体结合部位。Vasostatin蛋白通过与该区域结合,影响FAK、VEGF和bFGF等的信号通路,抑制血管生成。结论:酵母双杂交筛选获得的层黏连蛋白和整合素蛋白的3个蛋白片段,它们与肿瘤内血管内皮细胞增殖和迁移等密切相关。

真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）并了解其在真核细胞内的表达。方法 将带有Vasoatatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）的RT-PCR产物克隆至peDNA3.1（＋）真核表达载体上，经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后，以脂质体介导法转染真核细胞COS-7，并行Western法检测。结果 成功构建了真核表达质粒PeDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa），将之转染体外的真核COS-7细胞后，在其上清液中，检测到目的蛋白质。结论 该构建的质粒可在真核细胞中表达目的蛋白质，这为基因治疗视网膜新生血管类病奠定了一定基础。

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表达

目的构建真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)并了解其在体内外真核细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染体外培养的真核293T细胞及注射入鼠骨骼肌细胞中,了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果我们获取了包含带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)成熟肽及HA抗原在内的一段cDNA片段,并成功地与真核表达载体PcDNA3.1(+)连接,经测序表明,其中含有的带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)成熟肽的序列与Genebank上报道的序列完全一致。即我们成功构建了真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)。之后,在转染了该质粒的体外真核293T细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中,利用Western-blot法检测到了目的基因的蛋白质。结论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒PcDNA3.1(+)-Vasostatin(120-180aa)增强了蛋白分泌表达能力,这为进一步应用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础.

腺病毒介导vasostatin-1基因转染表达对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:构建并鉴定携带人嗜铬粒蛋白A的N端1～76片段(CGA1-76)即vasostatin-1(VS-1)基因的腺病毒表达载体,观察重组腺病毒在大鼠心肌细胞中的表达,探讨VS-1转基因治疗对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:(1)利用CGA1-58cDNA模板,设计引物,利用PCR合成、扩增CGA1-76的cDNA并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack,经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒pAd-VS-1线性化后转染QBI-293A细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad-VS-1,将该病毒感染大鼠心肌细胞H9c2并通过蛋白质印迹法检测其表达。(2)建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型,分为4组:空白组、H/R组、空载腺病毒转染+H/R组、Ad-VS-1转染+H/R组;测定各组心肌细胞活力,超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果:(1)经PCR、基因测序、酶切鉴定证实重组质粒pAd-VS-1构建成功,将其导入QBI-293A细胞,通过蛋白质印迹法证实病毒颗粒Ad-VS-1感染心肌细胞后VS-1蛋白表达。(2)H/R组心肌细胞活力和SOD含量较空白组明显降低,MDA增加;而VS-1基因转染提高了心肌细胞H/R模型心肌细胞活力和SOD含量,并降低了MDA生成量。结论:成功构建Ad-VS-1,将其感染大鼠心肌细胞后能够表达VS-1并对心肌细胞H/R损伤具有保护作用,其机制和抗氧化作用有关。

vasostatin在毕赤酵母中的表达及其抗血管生成的研究

目的:用酵母表达系统表达具有生物活性的vasostatin,并检测其抗血管生成活性。方法:将vasostatin基因克隆入酵母诱导型表达载体pPIC9K中,经过SacⅠ线性化、电转化毕赤酵母蛋白酶缺陷菌株Pichiapastoris KM17、筛选阳性克隆、PCR鉴定和DNA序列分析,获得了vasostatin基因重组到酵母染色体中的阳性重组子,阳性重组子经甲醇诱导和分离纯化,获得了重组vasostatin蛋白,CAM实验检测重组蛋白抑制血管新生活性。结果:酵母表达的重组vasostatin产量达12 mg.L-1,CAM实验表明重组vasostatin能够显著抑制新生血管生成。结论:酵母表达系统能高效表达具有抑制新生血管生成活性的重组vasostatin蛋白。

表达血管抑制因子的腺相关病毒载体的构建及其体内外活性

血管抑制因子(Vasostatin,VAS),为集钙蛋白N-末端180个氨基酸大小的蛋白,是一种内源性血管生成抑制因子,对多种肿瘤的生长具有很强的抑制作用。近期有研究显示,VAS可以促进神经内分泌肿瘤的恶化,提醒研究人员在开发该抗肿瘤药物时必须非常谨慎。将VAS cDNA插入腺相关病毒-2表达质粒pAAV-2,采用无辅助病毒参与的三质粒共转染法制备rAAV-VAS病毒。体外分别转染小鼠胰内皮细胞MS1和结肠癌细胞HCT-116,MTT法测定对细胞生长的影响,Western blotting方法检测VAS的表达。采用小鼠皮下移植瘤模型,验证VAS的表达对肿瘤生长、新生血管密度、以及细胞增殖的作用。结果证明构建的rAAV-VAS病毒载体,能抑制小鼠胰内皮细胞的生长,转染HCT-116后能有效表达VAS蛋白,但HCT-116的体外生长不受影响。瘤体注射rAAV-VAS后,HCT-116移植瘤在小鼠体内的生长速度明显减缓,肿瘤新生血管密度明显降低。结果显示,rAAV-VAS可以抑制HCT-116移植瘤的新生血管形成,但对其细胞增殖无明显作用。

人血管抑制因子的原核表达、纯化及活性研究

目的 :利用大肠杆菌表达系统表达人血管抑制因子 ,并利用镍金属螯合层析法进行纯化 ,探讨其抑制血管内皮细胞增殖的活性。方法 :采用RT PCR技术从人肝脏组织中获取人血管抑制因子的cDNA ,将其克隆至原核表达载体pQE30中进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS PAGE分析 ,并利用镍金属螯合层析法进行纯化。3H TdR法检测纯化的血管抑制因子对血管内皮细胞增殖的抑制作用。结果 :利用pQE30表达载体表达的含 6个组氨酸尾的vasostatin蛋白 ,在SDS PAGE上表现出一条约 2 1kD的阳性条带 ,经镍金属螯合层析纯化后的蛋白经肽指纹图谱分析鉴定为目的蛋白 ,在体外可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。结论 :人血管抑制因子可在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达 ,并具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。