布鲁菌基因缺失株△VceA的感染特征研究

本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测细胞炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。采用ΔVceA和亲本株S2308分别侵染HPT-8细胞和感染小鼠,对HPT-8进行胞内CFU计数,对小鼠脾脏内进行CFU计数,研究基因缺失突变株ΔVceA的感染特征。结果显示,基因缺失株ΔVceA和亲本株S2308的生长曲线在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;VceA基因缺失株在侵染细胞的初期胞内CFU计数低于亲本株,之后和亲本株无显著差异;基因缺失株ΔVceA在感染小鼠初期脾脏内CFU计数时低于亲本株,在感染后期和亲本株无明显差异;基因缺失株ΔVceA在侵染HPT-8细胞12 h时TNF-α和IL-1β的分泌量缺失株显著低于亲本株。结果表明,VceA基因的缺失不影响布鲁菌的生长繁殖,在布鲁菌感染细胞后影响细胞因子的分泌,胞内外的生存繁殖力明显下降,为深入研究布鲁菌IV型分泌系统的作用和功能奠定基础。

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,Western Blot检测其反应原性;用重组蛋白作用于细胞,检测炎症相关细胞因子的分泌量;并对该蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PCR扩增出VceA基因,SDS-PAGE显示纯化的VceA融合蛋白大约在37 kD处,Western Blot也出现了杂交带。细胞实验表明重组蛋白刺激细胞后产生的IL-18,IL-1β,TGF-β1的含量均显著高于BSA对照组(P<0.05)。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,并利用Phyre2软件成功构建了该蛋白的三维模型。结果表明,成功克隆并表达了布鲁氏菌Vce A蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,并具有致炎作用。这为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白的致病机制奠定了基础。

改进PCA及其在真空自耗炉故障诊断中的应用

针对过程变量呈均值阶段性变化的一类生产过程,提出了一种新的主成分分析(PCA)故障诊断方法.该方法通过高通滤波对过程变量进行状态变换,扩展系统,然后采用主成分分析方法对扩展系统进行统计建模,并基于该模型进行过程监测和故障诊断.该方法可以克服普通主成分分析不能消除均值变化对所建模型的负面影响,进而提高故障诊断的鲁棒性和灵敏性.将提出的方法在真空自耗电弧炉中进行应用研究,冷却水泄漏故障诊断结果表明,提出的方法是有效的.