刺葡萄类钙调蛋白基因VdCML8克隆与表达分析及其启动子转录活性测定

【目的】克隆刺葡萄类钙调蛋白基因VdCML8基因及其启动子序列,并对VdCML8基因进行表达分析,对其启动子进行转录活性测定,为深入探究该基因在葡萄抗炭疽病中的生物学功能提供理论参考。【方法】以刺葡萄紫秋为材料,采用RT-PCR技术克隆VdCML8基因及其启动子序列,对VdCML8蛋白的理化性质和二级结构进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测刺葡萄紫秋和欧洲葡萄红地球CML8基因在接种胶孢炭疽菌及外施水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)处理后的表达特征,通过构建β-葡萄糖苷酶(GUS)融合载体转化烟草进行转录活性检测。【结果】VdCML8基因的开放阅读框(ORF)长度为450 bp,编码149个氨基酸残基,具有EF-hand结构域,其二级结构中α-螺旋占65.10%,延伸链占4.70%,无规则卷曲占20.13%,β-转角占10.07%,该蛋白定位于细胞膜中。由系统发育进化树可知,刺葡萄VdCML8蛋白与欧洲葡萄VvCML8和河岸葡萄VrCML8的亲缘关系较近。VdCML8基因的启动子序列(pVdCML8)长度为1050 bp,除含有大量的CAAT-box和TATA-box外,还含有一些光响应元件(L-box、chs-CMALa和TCT-motif)、脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)、厌氧诱导响应元件(ARE)、防御和应激元件(TC-rich repeats)、伤害响应元件(WUN-motif)等。构建pVdCML8的瞬时表达载体pVdCML8::GUS,瞬时转化烟草后发现pVdCML8具有转录活性,且能驱动VdCML8基因表达。在接种胶孢炭疽菌后,刺葡萄紫秋VdCML8基因和欧洲葡萄红地球VvCML8基因表达均上调,均在接种后12 h达峰值,二者的相对表达量是对照组(清水处理)的22.08和9.30倍。SA处理3 h时,VdCML8基因的相对表达量是对照组的7.68倍,是VvCML8基因的2.76倍。JA处理6 h时,VdCML8基因达峰值,是对照组的22.25倍,是VvCML8基因的9.04倍。【结论】VdCML8基因是SA和JA信号途径的下游调控基因,SA和JA可诱导其高效表达,参与葡萄炭疽病响应过程,对提高植株抗病性具有一定作用。