靶向人c-Cbl基因重组干扰慢病毒与过表达腺病毒载体的构建、鉴定以及病毒功效研究

目的:构建可调控c-Cbl基因表达的重组慢病毒与腺病毒并评估其功效。方法:应用基因重组技术,分别构建靶向人c-Cbl基因的干扰慢病毒和过表达腺病毒。采用定量PCR和免疫印迹法检测病毒感染后白血病细胞(HL60、THP1)c-Cbl基因表达与转录本的变化。结果:3个靶向人c-Cbl基因的重组干扰慢病毒载体经测序验证构建成功,包装的病毒滴度均大于1×10^(8)TU/ml,其中shRNA-2号慢病毒干扰效率最高,白血病细胞感染后c-Cbl基因的表达约下调95%,CBL蛋白的表达约下调60%;同时,靶向人c-Cbl基因的重组过表达腺病毒载体也经测序验证构建成功,包装的病毒滴度大于1×10^(9)TU/ml,细胞感染腺病毒后,c-Cbl基因表达可瞬时上调约10倍,CBL蛋白表达约上调1.5倍。结论:重组干扰慢病毒和过表达腺病毒均可高效感染白血病细胞,并能分别下调和上调c-Cbl基因与CBL蛋白的表达,为后续研究肿瘤细胞内c-Cbl基因功能打下前期基础。

牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。

构建CLDN18.2慢病毒载体及其稳转细胞株的建立

目的构建表达人紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)的慢病毒载体,并通过慢病毒转导293T细胞获得稳定表达CLDN18.2的293T稳转细胞株。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因,将其插入质粒pWPT,构建pWPT-CLDN18.2慢病毒包装质粒。采用PCR对重组质粒进行鉴定,对重组质粒进行慢病毒包装后转导293T细胞系,同时设立未转让质粒的293T细胞作为对照组,得到293T-CLDN18.2混合克隆细胞。检测转染后目的蛋白水平及单克隆细胞阳性率。结果经PCR鉴定,在700 bp处有一条清晰条带与目的基因大小相符。在25~35 kDa处有明显条带,与预期28.8 kDa相符。表达CLDN18.2单克隆细胞的阳性率为99.3%。结论该研究成功获得稳定表达人CLDN18.2的293T稳转细胞株,为下一步的单克隆抗体的制备奠定了基础。

牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA筛选验证及慢病毒载体构建

旨在筛选在牦牛卵泡发育过程中可能吸附bta-miR-125b的长链非编码RNA(lncRNA),并构建双荧光素酶载体与慢病毒过表达载体,为研究调控牦牛生殖相关lncRNA的功能及机制提供基础。利用miRanda与RNAhybrid数据库预测可能靶向牦牛bta-miR-125b的lncRNAs,筛选出bta-miR-125b具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,由RNAhybrid进行结合位点预测,筛选出最优的lncRNA;采集牦牛卵巢分离卵泡并提取总RNA构建cDNA池,以RT-PCR技术扩增筛选所得lncRNA;在此基础上利用pmir-GLO载体构建技术构建该lncRNA野生型及突变型双荧光素酶报告载体,并将其与bta-miR-125b mimics共转染至293T细胞,检测双荧光素酶活性;最后利用慢病毒载体构建技术将测序正确的lncRNA与pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体同源区的片段同源重组,通过慢病毒包装系统(psPAX2:pMD2G)包装后感染293T细胞,计算感染效率及滴度。结果:两个数据库中的lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b存在紧密结合位点,扩增出lncRNA-ARS-UCD1.2的序列全长为1552 bp;双荧光素酶活性检测表明牦牛lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b mimic具有靶向关系(P<0.01);同源重组后经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒,感染效率达(61.520±0.875)%,感染滴度为4×10^(8)TU/mL,表明lncRNA-ARS-UCD1.2过表达慢病毒载体成功构建。综上,本试验筛选出牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA,并验证了两者的靶向结合关系,同时成功构建了该lncRNA的过表达慢病毒载体,为下一步深入研究lncRNA在细胞中的功能机制奠定了基础。

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

C5orf34基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建C5orf34基因的过表达慢病毒载体。方法通过聚合酶链反应(PCR)选择性扩增C5orf34基因目的片段,将目的片段连接至载体,利用基因重组技术构建带有C5orf34基因目的片段的重组载体,将重组载体转化到感受态细胞扩增并对阳性克隆的C5orf34过表达慢病毒载体进行测序,将正确重组的过表达慢病毒载体包装并转染色至293T细胞进行后续的慢病毒转染和滴度测定,采用实时定量PCR法检测C5orf34基因的过表达水平。结果经过测序比对显示,慢病毒载体与设计参考序列一致。重组慢病毒经包装并转染293T细胞后可观察到荧光,显示C5orf34过表达慢病毒载体滴度为1.0×10^(8)TU/mL。实时定量PCR的结果显示,在稳定转染C5orf34基因的细胞中C5orf34基因表达水平明显增高。结论成功构建C5orf34基因过表达慢病毒载体,为进一步研究C5orf34基因在肺癌发生发展过程中的机制奠定了生物学基础。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

SOX7基因慢病毒载体的构建及其在缺氧条件下对HUVECs增殖与迁移功能的影响

目的构建过表达SRY-box transcription factor 7(SOX7)基因的慢病毒载体,建立SOX7基因过表达的人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并在常氧和缺氧条件下探究过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。方法使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术扩增SOX7基因,通过同源重组法构建以pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen为载体的SOX7-pHAGE重组质粒。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot)法检测目的基因的mRNA和蛋白表达。将SOX7-pHAGE重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得含有SOX7-pHAGE慢病毒悬液,经浓缩后感染HUVECs,构建SOX7稳定感染细胞株。应用qPCR和Western blot技术检测SOX7基因的mRNA和蛋白的表达。在常氧及缺氧条件下,通过细胞划痕实验和CCK-8法检测过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。结果SOX7-pHAGE重组质粒经测序后,序列比对正确。qPCR和Western blot法成功检测出SOX7-pHAGE重组质粒转染的293T细胞在mRNA水平过表达约111.4倍(P=0.0028),在蛋白质水平上出现过表达条带;qPCR和Western blot技术成功检测到SOX7-pHAGE慢病毒感染的HUVECs在mRNA水平上显著升高约68.2倍(P=0.0030),在蛋白水平上显著升高约1.7倍(P=0.0043),SOX7-pHAGE重组质粒及SOX7稳定感染细胞株构建成功。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的迁移能力没有发生改变(P>0.9999),而在缺氧条件下其迁移能力增强约1.2倍(P=0.0044)。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的增殖能力增强约1.3倍(P=0.0087),在缺氧条件下其增殖能力也显著增强约1.4倍(P=0.0228)。结论SOX7稳定感染细胞株可促进HUVECs的增殖能力。在缺氧条件下,SOX7稳定感染细胞株可回补HUVECs被抑制的迁移和增殖能力。

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

GPx6过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

为了建立稳定表达谷胱甘肽过氧化物酶6(Glutathione peroxidase 6,GPx6)的真核表达细胞系,对GPx6进行基因克隆,构建慢病毒表达载体,建立表达猪源GPx6的CHO-K1细胞系.根据NCBI数据库中的猪GPx6基因的c DNA序列,利用Primer5设计PCR扩增引物.在猪附睾组织中克隆出6His-GPx6基因,构建含有6His-GPx6的慢病毒过表达载体,利用三质粒包装系统进行慢病毒包装,慢病毒侵染CHO-K1细胞,进一步筛选获得阳性单克隆细胞系,通过免疫荧光、蛋白印迹和实时荧光定量确定目的基因表达效果.试验成功克隆出6His-GPx6基因,构建了含有6His标签的GPx6过表达慢病毒载体,并成功获得了含有GPx6的CHO-K1细胞系.为下一步研究GPx6在猪繁殖力的提高和精液稀释液添加剂的应用提供新思路.

LAMB3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

目的 构建含有LAMB3基因的慢病毒表达载体,并感染HaCaT细胞,评价重组慢病毒载体提高LAMB3基因及蛋白表达的效果。方法 提取皮肤组织的总RNA,通过反转录方法扩增LAMB3基因,将其连入慢病毒载体pCDH-CMV中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行LAMB3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,浓缩纯化病毒液,感染HaCaT细胞并提取细胞的总蛋白和总RNA,用qPCR方法检测LAMB3 mRNA在感染病毒的HaCaT细胞中的表达,通过Western blot方法检测LAMB3蛋白在感染病毒的HaCaT细胞中的表达。结果 构建的慢病毒载体pCDH-CMV-LAMB3经测序分析证实基因序列正确。包装后的慢病毒滴度为108PFU/mL。qPCR方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3过表达组与空白对照组相比,LAMB3蛋白表达量显著增加,LAMB3蛋白在翻译水平有表达。结论 本研究构建的携带LAMB3基因的重组慢病毒能够感染HaCaT细胞,并使其LAMB3基因及蛋白含量增加。

MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

慢病毒载体Venus在HL-60细胞应用的可行性研究

随着对急性髓系白血病(AML)发生、发展的基因机制深入研究,构建转染效率高且对细胞无毒性作用的载体变得十分重要。为了研究补体C3a的受体蛋白C3aR1(complement component 3a receptor 1)在AML中的作用,构建了携带C3aR1的第三代慢病毒载体Venus。本研究主要观察Venus慢病毒载体在急性髓系白血病中应用的可行性。采用磷酸钙沉淀法将重组载体Venus-C3aR1转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,感染HL-60细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)观察感染效率,用RT-PCR和流式细胞术鉴定感染后HL-60细胞C3aR1的表达情况。用CCK8法绘制细胞生长曲线、观察细胞诱导分化能力来判断慢病毒载体的细胞毒性作用。结果显示,流式细胞仪(FCM)检测慢病毒感染率>95%,感染后HL-60细胞上C3aR1表达明显增加,病毒包装成功。慢病毒感染前后细胞生长曲线及诱导分化能力无明显变化,说明慢病毒载体不影响HL-60细胞的一般生物学特性,无明显的细胞毒性作用。结论:Venus慢病毒载体对AML细胞株HL-60的感染效率高,能够整合到细胞基因组中实现目的基因的稳定表达。慢病毒感染对细胞无明显的细胞毒性作用,不会干扰靶基因在细胞株中功能,因此慢病毒载体可以为白血病细胞的研究提供可靠的技术支持。

慢病毒载体介导的稳定表达eIF5A细胞系的建立及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列,双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞,包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞,经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化,病毒TCID50测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响,发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的增殖。

鞘内注射shRNA慢病毒载体缓解慢性炎性疼痛的机制研究

目的探究鞘内注射shRNA慢病毒载体对慢性炎性疼痛大鼠疼痛行为学及脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、OX42蛋白表达的影响。方法将54只SD大鼠随机分为正常组、空病毒组、慢病毒载体组,采用足底注射完全弗氏佐剂(CFA)建立大鼠慢性炎性疼痛模型,正常组大鼠足底注射生理盐水,鞘内注射PBS缓冲液;空病毒组和慢病毒载体组大鼠足底注射CFA,鞘内分别注射空病毒和慢病毒液。于建模前1 d及建模后第1、3、6、9、13天测量机械缩足阈值(PMWT)及热缩足潜伏期(PTWL);于建模后第3、6、13天留取大鼠L4~L5背根神经节(DRG)组织和脊髓节段组织,检测Nav1.7和GFAP、OX42蛋白表达水平。结果与正常组大鼠比较,空病毒组及慢病毒载体组大鼠PMWT值以及慢病毒载体组大鼠PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后逐渐升高;空病毒组PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后较第3天升高,但仍低于基础值。与空病毒组大鼠比较,慢病毒载体组大鼠PMWT、PTWL值从建模后第3天开始逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在建模后第3、6、13天,正常组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平基本无变化;空病毒组和慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较空病毒组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论鞘内注射shRNA慢病毒载体可抑制大鼠DRG中Nav1.7表达,抑制脊髓胶质细胞活化,下调GFAP、OX42蛋白表达,缓解大鼠慢性炎性疼痛。

过表达Miro1慢病毒载体的构建及Miro1高表达间充质干细胞稳定转染细胞株的建立与鉴定

背景线粒体转移是干细胞发挥免疫修复功能的重要机制之一,Miro1是线粒体转移过程的关键蛋白,但其动力学研究欠缺研究模型。目的构建过表达Miro1的间充质干细胞稳转细胞株,为线粒体动力学研究间充质干细胞的抗炎修复机制提供细胞模型。方法通过PCR扩增目的基因后进行Gibson反应、转化及Gateway等方法构建载体,并对载体进行酶切鉴定。慢病毒感染间充质干细胞后,使用嘌呤霉素进行药物筛选获得稳转细胞株。后续分为三组进行相关鉴定。(1)BMSC组:正常间充质干细胞;(2)Con-BMSC组:慢病毒空载体感染的间充质干细胞;(3)Miro^(Hi)-BMSC组:过表达Miro1的慢病毒载体感染的间充质干细胞。通过RT-qPCR、Western blot检测上述三组细胞Miro1的表达水平,并进行划痕试验、水平迁移实验、成骨及成脂诱导分化以鉴定干细胞特性。结果所构建的载体完成酶切鉴定,并成功获得过表达Miro1重组慢病毒载体pLV-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mRhot1/HA。经m RNA和蛋白水平检测,Miro^(Hi)-BMSC组的Miro1表达高于BMSC组和Con-BMSC组(P<0.05),干细胞水平、垂直迁移能力三组间差异无统计学意义(P>0.05),三组干细胞均可成功进行成脂及成骨诱导分化。结论通过慢病毒载体成功构建Miro1Hi-BMSCs稳转细胞株,且该稳转株仍保留干细胞特性,可用于间充质干细胞调控线粒体转移的相关研究。

小分子药物提高慢病毒对人γδT细胞感染效率的研究

γδT细胞识别靶细胞表面不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的抗原,高效杀伤靶细胞且不引起移植物抗宿主病(GvHD),作为细胞平台在同种异体CAR细胞疗法开发中具有良好的应用前景。慢病毒(Lentivirus)载体是CAR-T细胞制备中常用的基因递送手段,为实现γδT细胞中基于慢病毒载体的高效基因递送,本研究探索能够提高慢病毒滴度以及γδT细胞慢病毒感染效率的小分子药物。结果表明:组蛋白去乙酰化酶抑制剂M344和微管抑制剂Nocodazole可有效提高慢病毒滴度,其中当浓度为0.625μmol/L时,M344可提高慢病毒滴度至2倍以上。TBK1/IKK epsilon抑制剂BX-795可提高γδT细胞中慢病毒感染效率,当感染复数(MOI)为5时,BX-795可将感染效率从3.5%提升至10.7%,且未产生细胞毒性作用。本研究将为γδT细胞中基于慢病毒载体的基因递送优化提供一种新的策略,进一步推动γδT细胞在同种异体CAR细胞研究中的应用。

293T细胞生产慢病毒工艺优化

随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^(2+)浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^(*)P<0.05)。Ca^(2+)浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^(2+)浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。