荧光蛋白Venus载体构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的构建黄色荧光蛋白Venus重组载体,并观察其在哺乳动物细胞中表达情况。方法将Venus克隆至限制性内切酶处理的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,转染293T细胞,荧光显微镜下观察结果。48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术印证荧光蛋白Venus表达情况。结果重组载体经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T细胞后可见明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明荧光蛋白Venus高量表达。结论成功构建了Venus重组载体,荧光蛋白Venus在哺乳动物细胞中高表达,此为分子与细胞生物学提供了一种重要的研究工具。

慢病毒载体Venus在HL-60细胞应用的可行性研究

随着对急性髓系白血病(AML)发生、发展的基因机制深入研究,构建转染效率高且对细胞无毒性作用的载体变得十分重要。为了研究补体C3a的受体蛋白C3aR1(complement component 3a receptor 1)在AML中的作用,构建了携带C3aR1的第三代慢病毒载体Venus。本研究主要观察Venus慢病毒载体在急性髓系白血病中应用的可行性。采用磷酸钙沉淀法将重组载体Venus-C3aR1转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,感染HL-60细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)观察感染效率,用RT-PCR和流式细胞术鉴定感染后HL-60细胞C3aR1的表达情况。用CCK8法绘制细胞生长曲线、观察细胞诱导分化能力来判断慢病毒载体的细胞毒性作用。结果显示,流式细胞仪(FCM)检测慢病毒感染率>95%,感染后HL-60细胞上C3aR1表达明显增加,病毒包装成功。慢病毒感染前后细胞生长曲线及诱导分化能力无明显变化,说明慢病毒载体不影响HL-60细胞的一般生物学特性,无明显的细胞毒性作用。结论:Venus慢病毒载体对AML细胞株HL-60的感染效率高,能够整合到细胞基因组中实现目的基因的稳定表达。慢病毒感染对细胞无明显的细胞毒性作用,不会干扰靶基因在细胞株中功能,因此慢病毒载体可以为白血病细胞的研究提供可靠的技术支持。