基于油桐种子3个不同发育时期转录组的油脂合成代谢途径分析

油桐是我国重要的木本油料植物,过去对油桐的研究主要集中于栽培和常规育种,与油桐种仁油脂合成相关的分子机理研究还未见报道。文章采用RNA-seq技术对油桐种子油脂合成的3个不同时期的转录组进行比较,获得了大量差异表达的Unigene序列。在此基础上,通过GO分类和Pathway富集性分析将这些差异表达Unigene归类于128个代谢途径,其中包含与油脂合成相关的脂肪酸生物合成和甘油磷脂代谢途径。桐酸经脂肪酸生物合成途径合成后通过甘油磷脂代谢途径以桐油的形式贮存。将这两个代谢途径的Unigene序列在KEGG数据库中进行比对,获得了一些关键酶的同源蛋白质。文章通过对编码这些同源蛋白质的基因在油桐种子油脂合成期的表达模式进行分析,以期为油桐油脂合成,尤其是桐酸合成机理的解析提供理论参考,并为油桐的遗传改良提供潜在的基因资源,从而提高油桐的单位面积产量。

能源植物油桐在四川省边际土地种植潜力评价

通过分析油桐生长对自然因素的要求,借助GIS空间分析和多因子综合分析法建立油桐种植潜力评价模型;然后基于气象观测、土壤调查与遥感数据,以四川省边际土地为评价范围,对其进行评估。评价结果表明,油桐适宜和较适宜种植区主要分布在低山丘陵地区,对应的边际土地分别为46.14万和64.12万hm2,其中疏林地和灌木林地占适宜和较适宜土地总面积的99.15%,是油桐开发的重点区域;若这些边际土地按60%的垦殖指数种植油桐,每年收获的桐油可生产大约212万t生物柴油,该结果可为四川未来油桐的开发和规划提供有益参考。

油桐丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶的克隆与序列分析

为了深入了解油桐丙二酰单酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶(Malonyl Co A:ACP transacylase,MCAT)在油脂合成代谢过程中的作用,利用RT-PCR技术克隆获得了油桐MCAT基因序列,且命名为Vf MCAT,并利用相关生物软件对该基因序列及其相应蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明:Vf MCAT的CDS长为1 179 bp,编码392个氨基酸;该蛋白与蓖麻和亚麻的MCAT同源性均达85%,存在"GXSXG"和"GQGXQ"两个高度保守的motif,在系统进化关系上,其与蓖麻和亚麻的亲缘关系最为接近;分析其氨基酸序列后发现,Vf MCAT的分子量约为41.67 KDa,理论等电点p I为8.43,是一个含有一个跨膜结构域的可溶性稳定蛋白;对其二级和三级结构的预测结果表明,该蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,且最有可能在线粒体中发挥其主要作用,文中由此推测,Vf MCAT在叶绿体中参与了油桐脂肪酸合成代谢。

油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

油桐种胚再生体系的建立

为了建立快速有效的油桐再生体系,以"葡萄桐"种胚为试材,研究了贮藏方式、消毒时间、培养基及培养条件对油桐种胚成苗的影响。结果表明:种子沙藏与在自然条件下贮藏对油桐种胚成苗的影响无明显差异;种胚的最佳消毒处理为0.1%的升汞浸泡3 min;将种胚接种在1/2MS+IAA 0.5 mg/L的培养基中成苗率最高,为98%;在培养基中加入6-BA易使种胚产生大量的愈伤组织,不利于油桐胚再生体系的建立;培养基的最适pH值为5.5;与遮光处理相比,光照能缩短种胚再生体系建立的周期。

油桐种子FADX基因的克隆和序列分析

[目的]克隆油桐种子FADX基因全长cDNA。对该基因作生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能提供参考。[方法]以未成熟的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物;采用RTPCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,应用Antheprot软件和InterProScan对该基因进行了生物信息学分析。[结果]该序列5'端和3'端非编码区序列长度分别为13、47 bp,含有1个开放阅读框(14～1 174 bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域;相对分子量是44 343.0,理论等电点为8.33。二级结构预测表明,该蛋白α螺旋含量占29%,β折叠占32%,转角占6%。[结论]该蛋白属于脂肪酸脱氢酶。

油桐种子FAD2基因全长cDNA序列分析

油桐种子中FAD2催化形成的亚油酸是合成桐油酸的直接原料,研究油桐种子中的FAD2基因对提高桐油酸的产量具有实际意义。将油桐对年桐近成熟种子cDNA文库中的16个FAD2克隆子进行CAP3拼接,再进行BLAST比对,并进行DNAMAN分析,结果表明所克隆的基因序列为FAD2全长cDNA序列,其长度为1 537 bp,含有1个完整的编码序列,长度为1 146 bp(106～1 255 bp),编码383个氨基酸。酶蛋白相对分子质量44 144.4 u,等电点为8.57,氨基酸序列N端有6个残基的信号肽序列,有5个跨膜结构域,N端、C端及中间各有一段表现为强亲水性,酶活性中心为3个保守的组氨酸簇。在系统进化上,油桐FAD2基因与千年桐的亲缘最近,与蓖麻、乌桕、橡胶树、麻疯树等大戟科植物的亲缘关系较近,与油橄榄、花生、芝麻等植物的亲缘较远,与油茶的亲缘关系更远。

油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表达载体构建

α-桐酸合成酶是控制亚油酸向α-桐酸(18:3Δ9cis,11trans,13trans)转化的关键酶。本研究以发育中的油桐种子为材料,利用改良TRIzoL法提取总RNA,并根据GenBank中已经登录的α-桐酸合成酶基因FADX的序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法,克隆得到FADX基因全长cDNA,长度为1221bp。通过生物信息学分析结果表明,该序列5’端和3’端非编码区序列长度分别为13bp和47bp,含有一个开放阅读框(14～1174bp),编码386个氨基酸,含有典型的脂肪酸脱氢酶结构域。将所得基因经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI121,构建反义表达载体pBI121fadx。

油桐β-酮脂酰-CoA合成酶(KCS)基因的克隆与序列分析

为给油桐β-酮脂酰-CoA合成酶基因(KCS)结构和功能的研究提供参考,以油桐种子为材料,根据油桐转录组测序分析结果设计引物,利用RT-PCR技术克隆KCS基因,并进行了序列分析。获得了1条KCS基因的全长cDNA,命名为Vf_KCS。KCS基因的CDS长度为1 338 bp,编码446个氨基酸。该基因编码的蛋白质具有3个酶活性位点、6个产物结合位点、5个丙二酰-CoA结合位点和多个二聚体形成位点;Vf_KCS有2个明显的跨膜螺旋拓扑结构和3个疑似跨膜螺旋拓扑结构;二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲构成,该蛋白为亲水性蛋白。Vf_KCS编码的氨基酸序列与其它物种的KCS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与葡萄的KCS基因相似度最高达89.69%,与其它植物的KCS基因所编码的氨基酸同源性大多在80%以上。进化树分析结果表明,Vf_KCS与拟南芥亲缘关系最为接近。预测分析结果表明,该酶有高度保守的催化区域。

油桐烯脂酰CoA还原酶的克隆与表达模式分析

以葡萄桐近成熟种子为材料,根据油桐转录组数据库中已知部分烯脂酰CoA还原酶(enoyl-CoA reductase,ECR)序列,利用RACE克隆技术,克隆得油桐烯脂酰CoA还原酶的全长c DNA序列,命名为VfECR,并对该基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、蛋白质的二、三级结构、亲缘关系进行分析。结果表明:该基因全长1 154 bp,含有一个933 bp的开放阅读框,编码310个氨基酸,属于不稳定的亲水性蛋白,含有6个明显的跨膜结构域,且与陆地棉ECR蛋白的同源性最高,亲缘关系最为接近。同时利用RT-qPCR对VfECR基因的组织特异性和种子发育过程中的表达模式进行了分析,发现油桐Vf ECR基因主要在种仁中表达,在根、茎、叶等组织中表达量较少;在种子发育过程中,近成熟(8月、9月)到成熟种子(10月)中的表达量要明显高于未成熟种子(6月、7月)。

油桐亲环素基因全长cDNA的克隆及序列分析

亲环素基因广泛分布于各种生命体中,植物亲环素在植物生物学、胁迫应答、抗病原体免疫等方面起重要作用。根据油桐EST文库中的已知部分亲环素基因序列,通过5’RACE和RT-PCR,得到一个油桐亲环素全长cDNA序列。此基因全长为681 bp,包含一个长为519 bp的完整CDS,编码172个氨基酸,将该基因命名为vf_cyp。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质相对分子量18 038.5 Da,理论等电点8.68。通过预测分析表明该蛋白无跨膜结构,不存在信号肽切割位点,二级结构以β折叠和无规卷曲为主,分别占36.05%和52.91%,具有典型的肽脯氨酰顺反异构酶活性区及植物亲环素基因特有的7个氨基酸插入序列KS/MGKPLH,通过亲缘进化分析表明油桐亲环素氨基酸序列与橙、杂柑、毛果杨亲环素基因的氨基酸序列相似性分别达到94%、94%、93%。

油桐种子LOX基因的克隆与生物信息学分析

为了揭示油桐中α-桐酸生物合成的分子机理,利用RT-PCR和RACE技术,从油桐的种子中克隆到脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)基因的全长cDNA,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,此基因cDNA全长为2 690 bp,编码797个氨基酸。

不同油桐套种模式对土壤理化性质的影响

通过在油桐幼林中开展套种玉米、红薯和黄豆试验,并以纯油桐幼林为对照,研究油桐+玉米、油桐+红薯和油桐+黄豆套种模式对土壤的容重、比重、孔隙度等物理性质和全氮、全磷、全钾、水解氮、有效磷、速效钾、有机质和p H值等化学性质的影响。结果表明,油桐+玉米、油桐+红薯和油桐+黄豆套种模式均能改善土壤物理性质,也能显著提高油桐幼林土壤中全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾和有机质含量,分别比对照提高27.03%、40.50%、51.97%、57.03%、149.72%、109.34%和41.67%,油桐+红薯和油桐+黄豆模式对土壤理化性质影响优于油桐+玉米模式。

不同油桐套种模式对农作物农艺性状及经济效益的影响

为探索适宜油桐(Vernicia fordii Hemsl.)幼林套种的农作物,分析不同套种模式对作物主要农艺性状及经济效益的影响。结果表明,套种对红薯农艺性状(主茎蔓长除外)无明显影响,对黄豆株高、有效分枝数、有效荚数、单株产量等农艺性状有显著影响,对玉米穗粒重有显著影响;与单作相比,套种会导致黄豆产量下降29.02%、玉米产量下降14.47%。3种套种模式以油桐+玉米经济效益最好,每公顷收益8850元,其次为油桐+黄豆和油桐+红薯,每公顷收益分别为6 300元和6 150元。

不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗生长及生理指标的影响

选取1年生油桐幼苗为试验材料,研究不同温度下油菜素内酯(BR)对油桐幼苗生长及生理特性的影响。结果表明:8℃和38℃2种不同温度胁迫下,2个油桐物种幼苗生长减缓,叶片及栅栏组织变薄,叶绿素含量和SPAD值下降,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性升高,可溶性糖和可溶性蛋白含量增加,丙二醛(MDA)含量上升。相同温度下,叶片喷施BR可以使油桐幼苗生长量增加,叶片及叶片栅栏组织加厚,叶绿素含量和SPAD值上升、POD和SOD活性增加,可溶性糖和可溶性蛋白含量提升,叶片相对含水率(RWC)增加,MDA含量降低。说明BR可以减轻温度胁迫对油桐叶片的抑制程度,增强油桐叶片的生理功能,提高叶片内各种抗氧化酶活性,降低MDA对细胞膜的毒害作用,进而增加油桐幼苗的抗热性和抗寒性,加快油桐幼苗有机物的积累,最终使生物量增加。

油桐4个优良家系主要经济性状分析

为给油桐良种选育提供参考依据,采用田间调查的方法,从湖南省湘西自治区永顺县青坪镇油桐种质资源收集保存库,选取4个油桐优良家系P005、P007、P009、P012作为试验材料,采用化学分析法、索式提油法、色谱分析等方法,对此4个优良家系的果实性状、种仁性状、桐油油脂脂肪酸成分及油脂的理化性质进行了比较分析。测定结果表明:家系P005的不饱和脂肪酸含量最高;家系P007的桐酸含量最高;家系P009的桐油品质最好;家系P012的出油率最高,其综合性状最好。4个优良家系各性状指标值各有高低,综合分析各项指标后认为,优良家系P005和P012均有较高的生产应用价值,不论是作为良种选育的原始材料还是直接用于生产繁殖,都是较好的选择。

油桐LACS4基因的克隆与原核及真核表达

长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在油脂代谢过程中发挥着重要的作用。以油桐近成熟种子为材料,在已构建的转录组数据库基础上,克隆得到一个油桐长链酰基辅酶A合成酶基因,在此基因c DNA全长序列的基础上,成功构建了油桐LACS4基因的真核表达和原核表达载体,其中,酵母表达载体p YES2-LACS4成功转入酿酒酵母菌株INVSc1中,并进行相关生长趋势分析;在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,原核表达载体p ET30a-LACS4也成功诱导表达,并获得大约为74k Da的表观分子量的相应目的蛋白。

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。

油桐叶片愈伤组织诱导及植株再生

以油桐无菌苗叶片为试材,研究不同种类及浓度的植物生长调节剂对愈伤组织诱导、分化、增殖及生根的影响。结果表明:叶片愈伤组织的最佳诱导培养基为1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-12,4-D,诱导率达100%;最佳分化培养基为1/2MS+3.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IBA+0.05 mg·L-1IAA,分化率为86.36%;最佳继代增殖培养基为MS+3.0 mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IBA;最佳生根培养基为1/2MS+0.1 mg·L-1IBA,生根率93.83%。炼苗后移栽到泥炭土:珍珠岩:蛭石=2:1:1的基质中,成活率达92%以上。

油桐叶柄高效直接再生体系的建立

以油桐无菌苗叶柄为外植体,研究植物生长调节剂对其离体培养及植株再生的影响。结果表明:叶柄直接诱导不定芽的最佳培养基1/2MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IAA,诱导率达91.67%;最佳继代增殖培养基1/2MS+3.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1 IBA+1.0 mg·L-1 GA3,增殖系数可达4.89;最佳生根培养基为1/2MS+0.05 mg·L-1 IBA,生根率96.18%。炼苗移栽到泥炭土:珍珠岩:黄土=2:1:1的基质中,成活率达93.55%以上。