肠出血性大肠杆菌Vero毒素-1B亚基克隆及序列分析

[目的]克隆肠出血性大肠杆菌Vero毒素-1B亚基基因。[方法]用PCR法扩增并回收Vero毒素-1B亚基基因, 将其与质粒pGEX-4T-2重组, 通过酶切图谱筛选出重组质粒, 并测序验证。 [结果]PCR扩增出 290bp左右的特异性条带, 将其克隆至载体中, 双酶切鉴定和PCR鉴定, 获得重组质粒pVT1B, DNA序列分析结果显示, 所克隆的基因序列和Genbank所收录的相同。 [结论]成功构建了重组质粒pVT1B, 为研究新型的肠出血性大肠杆菌疫苗及治疗用药奠定了基础。

艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究(英文)

背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性。本实验拟研究艰难梭菌A毒素诱导人肝癌细胞株(SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)凋亡的作用。方法:由脑心浸液对艰难梭菌VPI10463菌株培养产毒,经甲状腺球蛋白亲合层析和QSephrose层析提纯得到精制A毒素。对SMMC7721细胞的研究以Vero细胞为对照。抑制细胞增殖的检测采用MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测DNA碎片。结果:不同浓度A毒素(0.293～4.690mg·L-1)明显抑制了SMMC7721及Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与A毒素共同培养48h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化;SMMC7721细胞与A毒素共同培养48h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带。结论:A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡;A毒素对SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用。

产志贺毒素大肠杆菌多重PCR与Vero细胞毒实验对比研究

[目的 ]通过对比研究建立一种具有高特异性、敏感性的检测产志贺毒素大肠杆菌 (STEC)的实验方法。 [方法 ]应用多重 PCR和 Vero细胞毒实验方法 ,对比检测从疫区分离的 142株大肠杆菌菌株。 [结果 ]6 0株多重 PCR stx2或 stx1 阳性大肠杆菌 Vero细胞毒试验均阳性。 82株不含有 stx2 或 stx1 基因大肠杆菌 Vero细胞毒试验均阴性。两者试验结果完全吻合。 [结论 ]多重 PCR方法检测 STEC stx2 和 stx1 具有高度的特异性和敏感性 ,可作为鉴定大肠杆菌是否为

改良Vero细胞毒性试验法检测志贺毒素

采用Vero细胞培养法检测5株肠出血性大肠杆菌O157食品分离株的志贺毒素。在48孔细胞培养板中培养Vero细胞24 h,然后加入梯度稀释的志贺毒素滤液。培养24 h及48h后在倒置显微镜下观察Vero细胞形态。培养48 h后结晶紫染色,测定Vero细胞半致死时,对应的志贺毒素滤液稀释倍数。证实形态观察和结晶紫染色相结合可以准确测定肠出血性大肠杆菌O157食品分离株的志贺毒素。

Vero细胞检测出血性大肠杆菌O157:H7毒素的方法研究

目的建立用Vero细胞检测大肠埃希菌毒素的方法。方法用两种不同的培养基培养10株大肠杆菌和1株痢疾志贺杆菌,将其培养物上清和菌体裂解液加入Vero细胞中,观察对Vero细胞的毒性作用。结果两种培养基培养大肠杆菌产生的上清对Vero细胞的毒性作用差异不大,大肠杆菌培养上清的毒性作用大于菌体,而痢疾志贺菌菌体的毒性作用大于上清。结论Vero细胞毒性检测方法可以用于检测出血性大肠杆菌细胞毒素。

Vero细胞法检测白喉抗毒素的研究

参照Ｍｉｙａｍｕｒａ等报道，建立了微量细胞培养检测白喉抗毒素的方法。以家兔皮肤试验为参照，Ｖｅｒｏ细胞培养法敏感度为９８．１１％，特异度为８４．００％，符合率为９６．２０％，相关系数ｒ＝０．９３。

Vero毒素-1的纯化及特性分析

从含有VT1全基因的基因工程菌中纯化出VT1。纯化的步骤包括 (NH4 ) 2 SO4 盐析 ,两次DEAESepharoseFastFlow柱层析。最终从 4L培养物中纯化出 1 5mg纯毒素 ,收率为 8 6 % ,梯度Native PAGE测定毒素的分子量为 70kD ,SDS PAGE电泳表明毒素有两个亚基 ,分子量分别是 32kD和 7 7kD。对VT1的多种生物学特性进行了研究 ;经测定VT1对Vero细胞的半数致死量CD50 为 1pg ,对小鼠的半数致死量LD50 为 18ng ,引起兔肠襻积液的最小毒素量是 1 2 5

MTT比色法测定Vero毒素-1的CD_(50)

〔目的〕测定Vero毒素 - 1对Vero细胞的毒性。〔方法〕用MTT法测定Vero毒素 - 1Vero细胞的毒性。〔结果〕Vero毒素 - 1的CD50 为 1pg。〔结论〕MTT法方法简便 ,灵敏度高 ,且没有同位素的污染 ,是测定Vero毒素 - 1细胞毒性的一个简便方法。

Vero毒素-1B亚基基因克隆及表达

目的:构建表达Vero毒素-1B亚基的重组质粒。方法:用PCR法扩增并用低熔点琼脂糖法回收Vero毒素-1B亚基基因,将其与质粒pGEX-4T-2重组,通过酶切图谱和序列分析法筛选出重组质粒。将含重组质粒的宿主菌诱导表达后,提取全菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果:获得了克隆有Vero毒素-1B亚基基因的重组质粒,经诱导后表达分子量为34 kDa的新蛋白。结论:重组质粒pVT1B的构建和表达成功说明克隆的Vero毒素-1B亚基基因具有完整的阅读框架,使简便获得Vero毒素-1B亚基成为可能,为以后研究新型的肠出血性大肠杆菌疫苗及治疗用药奠定了基础。

出血性大肠杆菌O157:H7破碎方法的比较

为更有效和便捷的提取出血性大肠杆菌O157:H7的非洲绿猴肾细胞(vero)毒素,比较了超声破碎法,多粘菌素法和反复冻溶法破碎细菌对毒素释放的效果,结果表明,超声破碎法破碎完全,毒素释放最多,多粘菌素法快速方便,也可使毒素大量释放,冻溶法破碎不完全,释放毒素最少。

检出山梨醇阳性肠出血性大肠杆菌O157:H7一例及特征分析

目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7(entro-hemorrhaguc E.Coli O157:H7 or EHEC O157:H7)是具有强致病力的条件致病菌,该菌可通过污染的食物、水、以及直接接触感染的人或动物而感染。加强对该菌的检验,对预防与控制由该菌所致的感染流行十分重要。方法:本文参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0973-2000方法进行检验。结果:从进口冻猪肚中检出一例EHEC O157:H7,并用PCR方法检测VERO毒素呈阳性。结论:该菌株的生化特征与相关文献报道的EHEC O157:H7生化特征不同的是山梨醇阳性,棉籽糖阴性,检验过程中应慎重鉴别。

VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备

以大肠杆菌O157DNA为模板扩增VT2-B亚单位,纯化后经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX4T-2,构建重组表达质粒pGEX4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了VT2-B-GST融合蛋白的可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的35%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,得到2株融合细胞,制备了腹水单抗,测得单抗的ELISA效价为104。Western blot表明,该单抗能与重组蛋白特异性的结合。特异性单抗的获得为VT2毒素检测方法的建立奠定了基础。

丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157 Stx毒素表达的影响

【目的】确定丝裂霉素C对溶原性大肠杆菌O157中Stx前噬菌体和Stx毒素的诱导作用。【方法】利用丝裂霉素C作诱导剂对8株溶原性大肠杆菌O157进行噬菌体诱导,以MC1061作指示菌采用双层琼脂平板法观察诱导前后的噬菌斑,并采用PCR方法对噬菌体进行鉴定。同时测定8株溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导前以及诱导8、12、16h这4个阶段滤液中Stx毒素的表达量,毒素表达量采用WST-1细胞毒性检测试剂盒检测Vero细胞存活率。【结果】溶原性大肠杆菌O157经丝裂霉素C诱导后释放大量的Stx噬菌体颗粒。同时诱导后Stx毒素的表达量也显著增加,且随着诱导时间的延长毒素的表达量继续增加,但增加的幅度逐渐减缓。【结论】本研究确定了丝裂霉素C可以诱导溶原性大肠杆菌O157释放Stx噬菌体,同时也增加了Stx毒素的表达,从而增强细菌的毒力。

武汉肉类食品中大肠杆菌O157∶H7分离株stx亚型和毒力特征分析

从22家市场销售的117份肉类食品中分离出4株大肠杆菌O157∶H7菌株,经PCR检测这4株菌的stx、hly、eae毒力基因均为阳性。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对这4株菌的stx亚型进行鉴定。3株菌同时携带stx1、stx2基因,且均为stx1a、stx2a亚型。菌株EC5.11仅携带stx2基因,但在所有的stx2分型PCR反应中都为阴性。用PCR扩增该菌株stx2基因全长并克隆测序,序列分析结果表明EC5.11志贺毒素基因为stx2c亚型。采用Vero细胞毒性实验检测这4株菌产志贺毒素的状况,结果显示这些菌株都具有一定的Vero细胞毒性。

大肠杆菌O157∶H7分离株的生物学特性分析

采用血清学、ＰＣＲ技术、生化反应、药敏试验、Ｖｅｒｏ细胞毒素测定等方法，对分离到的７株肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７菌株进行了综合分析。表明试验菌株用Ｏ１５７单克隆抗体和Ｏ１５７∶Ｈ７血清在做玻片凝集时，模式均较好；Ｈ７血清做试管定量凝集试验时亦均达到要求的稀释度以上；特异性ＰＣＲ技术检查时，测得１株试验菌株带有毒力基因；经全自动微生物鉴定系统检测２８种生化反应时，有１８种生化反应与９３３菌株完全相同，其余１０种生化反应各有不同，其中与９３３菌株有５种生化反应不同的有四株，４、３、１种生化反应不同的各一株。未发现与９３３菌株生化特性完全相等的菌株，亦未发现试验菌株间生化特性完全相同的。１２种常用抗菌素药敏试验显示对氯霉素、丁胺卡那霉素、菌必治均为敏感。对其它抗菌素均有不同程度的耐药。

stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒3种方法检测产志贺毒素大肠埃希菌的评估

目的评价stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒3种方法在检测产志贺毒素大肠埃希菌的特异性和敏感性的差异。方法运用stx-PCR方法、Vero细胞毒性试验和酶联免疫试剂盒分别对29株大肠埃希菌参考菌株和45株食品分离大肠埃希菌株进行检测。结果 stx-PCR方法可以判定50株菌携带stx基因,同时Vero细胞毒性试验可以判定这些菌株具有细胞毒性,两者的一致性为100%;酶联免疫试剂盒能判定其中38株菌具有志贺毒素。结论 3种方法都具有很好的特异性。stx-PCR方法和Vero细胞毒性试验较酶联免疫试剂盒具有更高的敏感性,试剂盒适用于食源性疾病暴发事件中产志贺毒素大肠埃希菌的快速筛选,stxPCR方法推荐作为实验室常规快速检测方法,Vero细胞毒性试验是检测产志贺毒素大肠埃希菌是否具有志贺毒素生物学活性的金标准方法。

检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立

目的 建立检测白喉毒素（diphtheria toxin,DT）特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法 用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的最适预稀释倍数.用建立的方法检测以最适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度（IC50）,同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果 目测法确定的DT最适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为（6.01±1.44）×10^-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值（log IC50）范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％ ～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.

猪水肿病毒素Stx2e的致Vero细胞凋亡作用

【目的】研究猪水肿病的致病因子志贺毒素2e(Shigatoxin2e,Stx2e)的致病机理。【方法】以AO/EB荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法和Western blotting等方法研究Stx2e对Vero细胞的致凋亡作用及其信号途径。【结果】从细胞形态学和染色质水平证明,Stx2e能诱导Vero细胞凋亡,并表现出时间和浓度依赖性;同时引起caspase-3表达量明显上调,Bax、caspase-9的表达量没有明显变化。【结论】Stx2e对Vero细胞的致凋亡作用主要通过膜受体通路引起,线粒体信号通路所起的作用较小。

肠出血性大肠埃希菌O157：H7Ⅱ型志贺毒素的纯化及功能鉴定

目的亲和层析纯化肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7Ⅱ型志贺毒素，并鉴定其生物学功能。方法用抗-Ⅱ型志贺毒素分子A亚单位的抗体S1D8耦联至柱填料Sepharose 4B，制备亲和层析柱。纯化EHEC O157：H7菌体分泌的毒素分子，分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法鉴定毒素分子纯度和特异度，将纯化毒素倍比稀释，观察其对Vero细胞和小鼠的毒性作用，计算其对细胞半数致死量（CD50）和对小鼠的全数致死量（LD100）；观察抗毒素血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用。结果通过亲和层析从EHEC O157：H7培养物中成功纯化Ⅱ型志贺毒素。SDS-PAGE显示，其A、B亚单位的相对分子质量分别为32000和7500，纯化的毒素分子可分别与Ⅱ型志贺毒素A、B亚单位特异性的单抗结合；对Vero细胞和小鼠均存在致死作用，其CD50和LD100分别为20ng／L和5ng，小鼠体内抗毒素血清对毒素可有效中和。结论成功纯化Ⅱ型志贺毒素，并证实其在细胞和动物模型中的毒性作用。

Penner19空肠弯曲菌毒素的细胞毒性作用研究

目的 探讨Penner 19空肠弯曲菌毒素 (CJT)对细胞毒性的影响。方法 (1)应用CHO及Vero细胞检测CJT毒性效应 ,以及CJT抗血清和GM1中和 /抑制作用 ;(2 )ELISA检测CJT结合GM1、CHO细胞受体 ,评价CJT抗血清及GM1中和或抑制作用。结果 (1)CJT对CHO和Vero细胞均具毒性 ,效应最低CJT量均为 3 12 5mg/L ,细胞变形率分别为 (5 7 3± 5 6 ) %及 (5 8 6± 5 2 ) % ,变形细胞中死亡率分别为 (5 3 8± 6 2 ) %及 (37 2± 6 9) %。对照组细胞变形率分别为 (8 6± 2 1) %及 (7 3±2 4 ) % ,显著低于CJT组 (P <0 0 1)。 (2 )与GM1呈阳性反应的CJT最低量为 1 5 6 3mg/L ,吸光度差值(P -N)为 0 2 4± 0 0 1(P >0 2 0 )。 (3)CJT抗血清可中和CJT毒性效应 ,其 1∶8及 1∶1倍稀释时 ,细胞变形率分别 <5 0 %和 <10 % ,与对照组比较差异有显著意义 (P <0 0 1)。 (4)GM1由 0 0 1增至 0 0 8μg/10 0 μl时 ,CJT致细胞形变率逐渐下降 ,继续增加GM1剂量 (0 0 8～ 0 6 4 μg/10 0 μl) ,细胞变形率却维持不变 ,且始终大于 5 0 %。 (5 )CJT结合CHO于作用后 3min最明显。CJT抗血清及GM1均可导致CJT结合CHO细胞能力减低。CJT抗血清完全抑制 ;而GM1部分抑制。结论 CJT对细胞可产生形态及致死?