SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的 克隆表达SARS CoVS1蛋白 ,构建SARS基因疫苗。方法 从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS CoVS1蛋白的编码序列 ,将该序列克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。采用脂质体法转染VeroE6细胞 ,用Westernblot检测S1蛋白的表达。结果 PCR方法扩增出 2 0 0 0bp左右的基因片段 ,插入pVAX1构建重组表达载体后 ,经序列测定证实扩增的片段为SARS CoVTor 2株S1蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞 ,收集细胞总蛋白 ,Western检测获得特异蛋白带。结论 成功克隆并表达了SARS CoVS1蛋白 。

流行性出血热病毒在Vero一E6细胞内引起细胞病变作用的新发现

自McCormick等发现Vero-E6细胞对流行性出血热病毒的敏感性后,国内外已有不少学者应用该细胞进行病毒分离和试验研究,但均未发现病毒在该细胞内规律性病变。病毒的存在和滴度只能按免疫荧光法(IFA)证实和测出。本文应用我国分离的出血热病毒在Vero-E6细胞上培养和观察,发现病毒在该细胞上出现有规律的病变并能测出病毒滴度,病变能被特异性中和抗体中和。现将结果报道如下。

用Vero-E6细胞大量增殖恙虫病立克次体的研究

目的 为了探讨建立一种简便而可靠的恙虫病立克次体增殖方法， 以得到较大量的恙虫病立克次体。方法 采用了以 Ｖｅｒｏ － Ｅ６ 细胞增殖恙虫病立克次， 并且对 Ｖｅｒｏ － Ｅ６ 感染细胞的培养条件进行了改进。结果 成功地使恙虫病立克次体在 Ｖｅｒｏ － Ｅ６ 细胞中得到大量增殖。结论 改进后的 Ｖｅｒｏ － Ｅ６ 细胞培养法可以获得大量的恙虫病立克次体， 该方法既经济又适用。

新型冠状病毒在Vero-E6细胞中的增殖特征分析

目的了解新型冠状病毒(2019-nCoV)在Vero-E6细胞中的增殖特征,为病毒的分离培养、抗病毒药物研究以及疫苗研制等工作提供基础。方法将2019-nCoV做半对数系列稀释,测定病毒的半数组织培养感染剂量(TCID 50);以1.74×10^-4 TCID 50/cell的病毒量感染Vero-E6细胞,在病毒吸附后第0~6 d分别收集病毒培养上清,测定上清中病毒感染滴度和病毒核酸拷贝数;测定病毒储存液冻融/非冻融、不同细胞悬液浓度、病毒吸附后洗涤/不洗涤等不同实验条件下的TCID 50。结果2019-nCoV感染Vero-E6细胞后,48 h内培养上清中的病毒TCID 50和病毒核酸拷贝数到达或接近峰值,平均复制周期约为3.29 h;48 h后上清中病毒核酸拷贝数维持在较高水平但病毒感染滴度逐渐下降。病毒储存液的冻融、细胞浓度以及病毒吸附后洗涤等培养条件可轻微影响病毒TCID 50。结论2019-nCoV感染Vero-E6细胞在早期增殖迅速,感染后期病毒感染滴度逐渐下降,但病毒核酸拷贝数在上清中维持在较高水平。

用原子力显微镜观察汉坦病毒感染前后Vero-E6细胞的形貌变化

目的用原子力显微镜(atom force microscope,AFM)观察汉坦病毒感染前后Vero-E6细胞的形貌变化。方法①用不同浓度的戊二醛固定细胞;②用不同稀释度的病毒感染细胞;③用同一稀释度的病毒分别感染细胞15、30、45、60、75、90分钟。结果①用0.5%和1.0%的戊二醛处理的细胞形态正常;用1.5%和2.0%的戊二醛固定的细胞表面凸凹不平孔洞较多,大部分细胞皱缩。②用不同稀释度的病毒感染过的Vero-E6细胞,与正常细胞相比,细胞表面粗糙,在细胞核周围有孔洞出现,但稀释度不同出现孔洞的数量也有差别,细胞表面光滑程度也有不同。③用同一稀释度的病毒感染细胞不同时间,发现细胞的形貌、表面粗糙度及细胞表面的孔洞数量都有了变化。结论用AFM技术可以观察到病毒感染前后细胞的超微结构,近似的反映出病毒感染细胞的动态过程。

猪流行性腹泻病毒蛋白对Vero E6核蛋白B23.1的影响

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白N对Vero E6细胞核仁蛋白B23.1的影响,将本实验室构建的DsRed-N1/B23.1重组质粒转染Vero E6细胞,转染6h后接种PEDV,分别在转染后12、18h和24h三个时间点,进行病毒感染细胞的间接免疫试验,同时设未感染对照组,而后利用激光共聚焦显微镜分析感染和转染细胞中B23.1蛋白的变化。结果表明,PEDV N蛋白与Vero E6核蛋白B23.1有共定位特征,在PEDV感染Vero E6细胞12h后,B23.1蛋白开始发生变化,随着时间的延长逐渐碎裂、分散。这个结果提示,病毒可能通过破坏核仁的结构和核仁蛋白的功能,进而为病毒的复制提供便利。

Vero E6细胞中B23.1基因的扩增及其原核表达

应用RT-PCR技术,利用含有酶切位点的上、下游引物扩增得到Vero E6细胞中编码B23.1蛋白的基因片段,并进行序列测定及分析,结果表明,B23.1基因含有一个长901bp的开放阅读框(ORF),未发现碱基的插入和缺失。将其进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,而后定向克隆到经相同双酶切的pGEX-6p-1载体中,构建的重组质粒命名为pGEX-6p-B23.1;将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达;SDS-PAGE结果表明,表达出与预期大小相符的约68ku的重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting分析结果表明,表达的重组蛋白与B23蛋白单克隆抗体有很好的反应活性。

汉坦病毒通过线粒体途径诱导Vero E6细胞凋亡

目的探讨汉坦病毒诱导非洲绿猴肾细胞Vero E6凋亡的机制。方法汉坦病毒感染VeroE6细胞后应用Western blot检测胞浆内汉坦病毒核心蛋白(N蛋白)的表达情况,应用DNA-ladder和流式细胞术检测汉坦病毒感染Vero E6细胞诱导凋亡的发生,用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cyt-c及Caspase-3的表达情况。结果汉坦病毒感染Vero E6细胞后,在胞浆内检测出汉坦病毒N蛋白。流式细胞仪检测到凋亡峰,DNA电泳可见典型的DNA梯带。Western blot显示随着感染时间的延长,Cyt-c蛋白及Caspase-3酶原活化片段表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。结论汉坦病毒通过线粒体途径诱导Vero E6细胞凋亡。

基于Vero E6细胞的抗SARS药物筛选方法的构建(英文)

目的构建基于Vero-E6细胞的抗SARS药物筛选模型。方法运用四唑氮化合物(MTS)方法,对由SARS病毒(BJ-01)引起的对Vero-E6细胞的细胞毒性作用进行检测。首先优化了实验条件(检测了MTS不同孵育时间和不同接种细胞数对测试结果的影响,并绘制了病毒滴度曲线);在检测化合物的抗病毒作用时,首先将细胞接种于96孔板中,加入待测药物和BJ-01病毒,48h后用显微镜观察细胞形态变化,96h后加入MTS和电子耦联剂(PMS)的混合溶液,在490nm检测其吸光度。结果对4000多种化合物的抗SARS病毒作用进行了检测。获得10种可能有抗SARS病毒作用的药物。结论基于Vero-E6细胞的MTS检测方法提供了一种快速、安全和方便的抗SARS药物筛选方法。

SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡

为了确定SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染Vero E6是否引起细胞凋亡,我们利用细胞DNA琼脂糖电泳,感染细胞的间接荧光染色和Hoechst 33258细胞核染色,以及流式细胞仪分析等方法证明了SARS-CoV感染的Vero E6具有典型的凋亡细胞学和生物化学特征。实验证明具有细胞凋亡特征的所有细胞均为处于感染晚期的细胞。表现明显细胞病变(CPE)的细胞大多已经出现核质凝缩或形成凋亡小体进入细胞凋亡的过程。可以断定SARS-CoV感染Vero E6细胞诱发了细胞凋亡。

VeroE6细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为寻找与猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）相互作用的VeroE6细胞蛋白，深入研究病毒感染机制，本试验建立了一个VeroE6细胞酵母杂交cDNA文库。采用Trizol试剂从培养的VeroE6细胞中提取细胞总RNA，通过SMART技术合成双链cDNA，并利用同源重组的方法构建VeroE6细胞的酵母cDNA文库。结果显示，文库滴度为9．7×10^8 CFU／mL，插入的双链cDNA片段大小为0．5～3kb，平均长度约为1．6kb，文库重组率为87％，此文库可以用来筛选与病毒相互作用的VeroE6蛋白。该文库的构建为发现和研究与PEDV结构蛋白相互作用的宿主细胞蛋白奠定基础。

基于Vero E6细胞的水痘-带状疱疹病毒抗膜抗原荧光抗体试验的建立与评价

目的 建立并评价基于非洲绿猴肾细胞(Vero E6)的水痘-带状疱疹病毒(VZV)抗膜抗原荧光抗体(FAMA)试验方法。方法 在VZV-Oka减毒活疫苗株在Vero E6细胞中的适应培养毒株VZV-Oka-E6的基础上,首先使用3个不同感染剂量(10、10和10TCID)的VZV-Oka-E6病毒株感染Vero E6细胞,于显微镜下观察病变情况确定最佳的VZV-Oka-E6病毒株感染量;然后对比使用不同固定液固定感染细胞后制备的固定抗原片可检测到的灵敏度确定最优的固定液,从而建立基于Vero E6细胞的中和抗-VZV检测FAMA试验方法;采用建立的FAMA法,检测不同效价的VZV免疫球蛋白国际标准品,确定该方法的敏感性;检测人单纯疱疹病毒(HSV)1、2型特异性抗体,评价该方法的特异性;分别使用同一批次制备和4个不同批次制备的VZV感染细胞固定抗原片检测VZV免疫球蛋白国际标准品的中和抗-VZV,确定该方法的批内和批间重复性;检测已知的3种效价的VZV免疫球蛋白国际标准品,评价该方法的相对准确性。分别应用新建立FAMA法和ELISA法检测20(人)份单采血浆样品的抗-VZV效价,对2种试验检测结果做Spearman相关性分析。结果 通过优化确定了FAMA试验中最佳的VZV-Oka-E6病毒株感染量为10TCID,-20℃预冷的丙酮作为固定液。FAMA试验检测中和抗-VZV效价的灵敏度为31.25 mIU/mL;检测HSV 1、2型特异性抗体时结果为阴性;使用同一批次和4个不同批次制备的VZV感染细胞固定抗原片检测VZV免疫球蛋白国际标准品,变异系数分别为29.95%和26.71%;对3种效价VZV免疫球蛋白国际标准品的检测(值)与其理论值一致;FAMA法和ELISA法对20份单采血浆样品检测抗-VZV结果的相关系数为0.268。结论 所建立的FAMA试验检测中和抗-VZV效价具有良好的敏感性、特异性、重复性和相对准确性,可用于单采血浆和水痘-带状疱疹免疫球蛋白(VZIG)产品的中和抗-VZV效价检测。

一氧化氮对HSV-1在HeLa细胞和Vero-E6细胞中增殖的影响

以硝普钠作一氧化氮供体，观察不同剂量一氧化氮存在条件下ＨＳＶ１在ＨｅＬａ细胞和ＶｅｒｏＥ６细胞中增殖情况。结果表明：一氧化氮对ＨＳＶ１在ＶｅｒｏＥ６细胞中增殖有明显抑制作用，而对ＨＳＶ１在ＨｅＬａ细胞中增殖无明显影响。提示一氧化氮的抗病毒作用存在着细胞敏感性差异。

蝙蝠呼肠孤病毒感染BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较观察

目的通过对蝙蝠呼肠孤病毒在BHK-21和Vero-E6细胞形态发生的比较研究,筛选出该病毒的最佳宿主细胞。方法将感染呼肠孤病毒XJV株的BHK-21和Vero-E6细胞用戊二醛、锇酸固定,制成超薄切片,用透射电镜观察。同时测定病毒滴度。结果XJV在2种细胞中的适应程度不同,XJV更适于在BHK-21细胞中增殖。XJV在2种细胞中的形态发生不同,在BHK-21细胞中形成的包涵体呈典型的晶格状排列,在Vero-E6细胞中形成的包涵体呈杂乱的球状。XJV用BHK-21和Vero-E6细胞育传5代,病毒滴度分别为105.5TCID50/ml和104.5TCID50/ml。结论BHK-21细胞是蝙蝠呼肠孤病毒XJV株的最佳宿主细胞。

不同固定液对Vero E6细胞形态和染色的影响及在病毒噬斑分析中的应用

病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素。为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100%甲醇、4%甲醛、10%甲醛、75%乙醇和95%乙醇)。以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组。细胞固定30 min后利用1%结晶紫进行染色。利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果。结果显示,10%甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂。

恙虫病东方体在无生命培养基内生长的研究

目的 恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi;Ot)被认为属专性细胞内寄生。特别是制备大量抗原培养难的问题 ,是近一个世纪以来人们渴望解决的难题。为证实是否能在无生命培养基生长。方法 用Vero -E6个单层组织细胞培养OtJL - 90株与标准Gilliam株 ,在合适时取该培养物接种于Ⅲ号无生命固体培养基培养 ,置 36℃ (± 1℃ )培养 18- 2 4h。结果 可见生长一群无色透明或半透明光滑、湿润、圆形或枫叶样小菌落 ,并产生一种难闻的臭味。两种方法培养物分别做了生物学性状鉴定、形态染色、小白鼠致病力、血清学特异性间接免疫荧光检测。各株Ot经两种培养获得培养物特性基本一致。结论 Ot能在细胞内生长也能在无生命培养基内生长 ,解决了Ot大量抗原培养难的困扰。

新疆出血热病毒免疫荧光试验检测结果报告

目的了解新疆出血热(XHF)的自然界分布状况。方法对采自塔里木盆地、准噶尔盆地、伊犁谷地和东疆盆地23个县(市)的96份病原材料分别接种Vero-E6细胞,病原材料经细胞培养后,胰酶消化制备细胞片,应用免疫荧光试验(IFA)对细胞片进行病毒检测。结果96份病原材料中,检出新疆出血热病毒颗粒阳性材料16份,分布地区包括巴楚、于田、轮台、民丰、尉梨、莫索湾、吐鲁番和木垒。结论巴楚、于田、轮台、尉梨、莫索湾和木垒地区存在新疆出血热的自然界分布,而民丰和吐鲁番仅从羊血液标本中查出阳性,不能说明该地区存在新疆出血热的自然界分布。

非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰

非洲绿猴肾细胞 (Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染到Vero-E6中 ,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)对其表达进行干扰。结果显示 :siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero -E6细胞中的表达 ,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero -E6细胞中 ,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。

新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)的分离和鉴定

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情对人类生命健康构成极大威胁。病毒的分离是构建新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)细胞感染模型和动物感染模型的基础。本研究利用冠状病毒易感的Vero E6细胞,从1例上海感染者的咽拭子中分离到一株2019-nCoV,命名为nCoV-SH01。对该毒株全基因组采用一代Sanger和二代Illumina法测序,发现该毒株与GenBank MN908947的同源性>99.99%。免疫荧光检测显示,该毒株与COVID-19康复者的血清呈阳性反应。当nCoV-SH01感染Vero E6细胞后,导致典型的合胞体病变,细胞病变效应明显且进展迅速,提示nCoV-SH01可用于进一步建立2019-nCoV的细胞感染和动物感染模型,为开展致病性研究以及抗病毒药物和疫苗研发奠定了基础。

抗传染性法氏囊病病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

原核表达的IBDVGx-VP5蛋白经纯化后免疫8周龄的BALB/c雌性小鼠,三次基础免疫后,融合前加强免疫,取脾细胞在PEG(MW1500)的作用下与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经过三次亚克隆筛选,获得稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为4B4、6D12、3E8,以三株杂交瘤细胞制备的腹水ELISA效价分别为5×104、3.5×104、3×104,特异性实验表明三株单抗能与IBDVGt株反应。以单抗介导的间接免疫荧光检测表达Gt-VP5的VeroE6细胞,可以见到特异的荧光,能做为特异性的检测VP5蛋白的工具,为今后IBDVVP5蛋白的研究打下基础。