新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

应用微载体Vero细胞制备流行性乙型脑炎灭活疫苗最适条件的研究

应用微载体培养Vero细胞研究制备流行性乙型脑炎(简称乙脑)灭活疫苗的最适条件,包括微载体的选择和细胞培养以及细胞日龄、细胞密度、毒种浓度、病毒维持液pH、种毒方式等。并按初步选择的最适条件试生产疫苗,其病毒滴度达log7.33～8.09pfu/ml,其效力(ID_(50))为0.000017～0.000063毫升,均高于现行地鼠肾细胞培养疫苗的水平。

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代。比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Veto细胞灭活疫苗。研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7．00～7．75LgCCID50／ml和1：3201：1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6．50～7．50LgCID50／ml和1：160～1：768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株Z34与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1：10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。

微载体培养MEK和Vero细胞试制甲肝灭活疫苗

目的探索微载体培养细胞大量制备甲肝病毒抗原及其灭活疫苗的可行性。方法使用 Cytodex- 1培养恒河猴胚肾细胞和 Vero细胞制备 HAV ,经过初步纯化、甲醛灭活、吸附佐剂 ,制成甲肝灭活疫苗 ,免疫昆明种小白鼠 ,测定免疫原性。结果 HAV X株和 W株抗原滴度分别为 1∶ 2 5 6、1∶ 12 8,感染滴度 (log TCID5 0 / m l)分别为 8.5 0、8.17,与静止培养获得的滴度相当。小鼠抗 HAV抗体第 45 d达到峰值 ,滴度分别为 1∶ (96 .0± 78.4)、1∶ (12 8.0± 70 .1)。结论实验性甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性 ,应用微载体培养细胞制备甲肝灭活疫苗是可行的。

原代地鼠肾细胞乙脑灭活疫苗中残余细胞基质的检测

目的找出多批原代地鼠肾细胞乙型脑炎灭活疫苗高过敏反应发生率的原因，提出解决方案。方 法利用ＨＰＬＣ排阻层析结合ＥＬＩＳＡ方法相对定量地分析高反应性和无反应性疫苗的残余细胞基质成分，并利用 凝胶过滤柱层析去除疫苗中细胞源性杂质。结果高反应性疫苗中地鼠肾细胞基质成分的残留量偏高；利用常压 凝胶过滤柱层析法可将残留的细胞基质成分几乎完全去除。结论本次过敏反应事件是由部分疫苗中地鼠肾细 胞基质成分残留量偏高所致，用一步分子筛柱层析处理疫苗是一种简单有效的解决办法。

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。

乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)中间品的稳定性

目的对乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)生产各阶段的中间品进行稳定性观察。方法将各阶段中间品置4℃保存,于不同时间取样,进行病毒滴度、抗原含量和小鼠免疫原性检测。结果4℃下病毒收获液14d内滴度下降8.0%,灭活收获液的抗原含量8周内下降7.3%。浓缩原液、鱼精蛋白处理原液、蔗糖区带离心原液抗原含量在12周内分别下降了9.7%、8.3%和8.3%,加保护剂脱糖原液12周内抗原含量下降了8.4%,稀配半成品24周内抗原含量下降了2.98%,但在12周内均保持了良好的小鼠保护效力。结论上述样品在4℃下,保存期限内均保持了良好的稳定性。

猪乙型脑炎病毒在Vero细胞上的繁殖特性及其灭活疫苗的免疫原性研究

试验旨在对猪乙型脑炎病毒(JEV,SA14-14-2株)在传代细胞上的繁殖培养特性及其制备的灭活疫苗免疫原性进行研究,确定猪JEV在细胞培养瓶中培养的关键技术参数及其灭活疫苗的免疫原性。以Vero细胞培养病毒,通过接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH、维持培养温度及培养时间7个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定病毒滴度。按照优化好的条件繁殖一批毒液,经β-丙内酯灭活,与双相佐剂混合,制备成猪乙型脑炎灭活疫苗。两次免疫(间隔14d)接种乙型脑炎抗体阴性仔猪,首次免疫前(0d)、免疫后第7、14、21、28、35、42天采集血清,检测血清中和抗体。二免后第28天进行乙型脑炎P3强毒的攻击,攻毒前(0d)、攻毒后第1、2、3、5、7、9天采集血浆,攻毒后第14天剖杀免疫猪,采集脑组织,检测血浆和脑组织中JEV。结果显示,用细胞培养瓶进行培养,将Vero细胞培养至48h进行病毒接种,接种量为1 000PFU/mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为90min,吸附后用pH 7.6～8.8维持液继续培养,培养温度为35℃,培养96h后收获毒液,冻融一次,可获得较高滴度的病毒。仔猪免疫制备的灭活疫苗后血清抗体水平迅速升高,血浆和脑组织中均未检测出JEV,免疫组试验猪能抵抗强毒攻击,可获得有效免疫保护。本试验结果为猪乙型脑炎疫苗的生产提供了参考依据。

精制甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)稳定性试验

目的观察精制甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)在不同温度保存条件下的稳定性。方法将甲型肝炎灭活疫苗于37℃和4℃放置不同时间后,免疫ICR小鼠,检测血清抗体效价和ED50值。结果3批疫苗经放置37℃21d及4℃3.5年后免疫小鼠,血清抗体水平和ED50值均无明显下降。4℃3.5年后其他理化指标均符合规定。结论精制甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)稳定性良好。

乙型脑炎活疫苗与灭活疫苗诱导小鼠体液和细胞免疫应答的比较

应用检测特异性CTL活性的方法检测乙脑活疫苗的细胞免疫应答 ,并以灭活疫苗作对照。结果显示活疫苗免疫小鼠后诱导的CTL均值为 79 2 % ,较灭活疫苗 2 9%高 5 0 2 % ,表明活疫苗具有较强的特异性CTL活性。用同批活疫苗免疫小鼠后其中和抗体效价为 1:5 ,而同批的灭活疫苗为 1:2 0 ,活疫苗的免疫效力 (ID5 0 ) 3 6× 10 6(ml)显著高于灭活疫苗的 4 0× 10 - 4 ～ 4 2× 10 4(ml)。表明乙脑活疫苗诱导的免疫应答中细胞免疫在保护效力中占有重要地位。

肠道病毒71型灭活疫苗上市后安全性监测与评价

目的 评价不同细胞基质制备的肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗上市后常规免疫安全性。 方法 EV71灭活疫苗疑似预防接种异常反应（AEFI）数据来源于中国免疫规划信息管理系统，为2017年接种EV71 灭活疫苗后江苏省报告的监测数据；受种儿童人口学信息和接种剂次数来源于江苏省预防接种信息管理系统。 结果 2017年江苏省共接种EV71灭活疫苗316 889剂，报告AEFI 208例，报告发生率为65.64/10万剂（95% CI ：56.72/10万剂～74.56/10万剂），其中一般反应55.54/10万剂（95% CI ：47.34/10万剂～63.74/10万剂），异常反应 7.89/10万剂（95% CI ：4.80/10万剂～10.98/10万剂）；不同细胞基质的疫苗AEFI发生率（χ 2 =35.61， P ＜0.01）和一般反应发生率（χ 2 =34.09， P ＜0.01）差异有统计学意义，异常反应发生率差异无统计学意义（χ 2 =1.88， P =0.17），均未见严重异常反应，208例AEFI均未住院且均痊愈。EV71灭活疫苗（Vero细胞）首剂接种一般反应发生率高于第二剂（χ 2 =6.94， P ＜0.01），不同季度接种EV71灭活疫苗（人二倍体细胞）一般反应发生率差异有统计学意义（χ 2 =18.86， P ＜0.01）。 结论 不同细胞基质的EV71灭活疫苗在常规免疫接种中AEFI发生率均不高，有良好的安全性；一般反应以发热为主，异常反应以过敏性-荨麻疹、过敏性皮疹和过敏性斑丘疹等过敏性反应为主。

HFRSV在Vero细胞上的传代适应及疫苗的初步研制

作者观察了肾综合症出血热病毒(HFRSV)Z_(10)株、HB_(55)株和L_(99)株在Vero细胞上的传代适应情况,并制备了3批灭活疫苗。试验结果表明,3批疫苗对家兔均有较好的免疫效果,动物经两次免疫后4周,血清中和抗体阳转率为100％。这一结果为应用Vero细胞制备HFRS灭活疫苗提供了有意义的科学数据。

利用MODDE软件全因子分析优化乙脑灭活疫苗的纯化工艺

目的:通过MODDE软件全因子分析实验方法建立一种乙脑灭活疫苗纯化新工艺,进一步去除乙脑灭活疫苗中细胞残留DNA。方法:将传统的Sepharose 6 Fast Flow层析所获得的初步纯化液作为样品,进行Sartobind Q膜层析,选取上样量、盐浓度、pH、流速4个因子为输入变量,以乙脑疫苗抗原回收率、细胞残留DNA去除率为输出响应值,使用全因子DOE模型进行实验。结果:在实验参数范围内[上样量(40~100 mL)、盐浓度(0.3~0.7 mol/L)、pH(6.0~8.0)、流速(1~20 mL/min)],增加Sartobind Q膜层析的样品细胞残留DNA低于每剂50 pg,去除率在90%以上。结论:通过应用DOE实验设计,找到Sartobind Q膜合适的工艺设计空间,有效去除乙脑灭活疫苗中的细胞残留DNA,提高疫苗临床应用的安全性。

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒。亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主。感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化。本研究初步建立了SV40 病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺。使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。随后对SV40 病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合。本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40 感染实验奠定了良好的基础。

接种灭活疫苗后的境外输入性新冠肺炎患者临床特征

目的通过比较接种/未接种新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)后感染新型冠状病毒(COVID-19)的境外输入性患者的临床特征,为临床诊疗提供参考。方法选取2021年1月4日—4月10日广州医科大学附属市八医院收治的接种灭活疫苗后境外输入性COVID-19患者(接种疫苗组),及同期来自相同输入国家的未接种新冠疫苗的确诊COVID-19患者(未接种疫苗组)为研究对象,通过比较两组患者的人口学特征、临床症状、血液检查结果及抗体、胸部影像学、治疗方法及预后等,分析总结接种灭活疫苗后境外输入性COVID-19患者的临床特征。结果接种疫苗组、未接种疫苗组分别纳入38例患者,患者的平均年龄分别为(37.14±8.86)岁、(39.21±7.66)岁;男性58例,女性18例。两组患者的临床症状中,除了未接种疫苗组患者出现咽喉不适比率高于接种疫苗组(34.21%VS 13.16%,P<0.05),其余临床症状两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者血白细胞、淋巴细胞、肝肾功能、心肌酶学、氧合指标、D-二聚体等指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组患者病程中出现炎症指标升高的比例、T淋巴细胞CD4^(+)、CD8^(+)下降的比例比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在病程前2周内,接种疫苗组患者新型冠状病毒抗体IgG阳性比例均高于未接种疫苗组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者的肺部影像学情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论接种灭活新冠疫苗(Vero细胞)后境外输入性COVID-19患者以青中年男性为主,临床分型以核酸检测阳性及普通型患者居多,所有患者经治疗后均预后良好。接种灭活疫苗(Vero细胞)后再感染新型冠状病毒患者较未接种疫苗的患者,在病程早期(1周内)即迅速产生IgG抗体,但核酸转阴时间较长。

全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗获批上市

本刊讯2015年1月14日，国家食品药品监管总局批准了全球首个Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（单苗）的生产注册申请。该疫苗是由中国医学科学院医学生物学研究所研发，通过采用现行脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产毒株（ Sabin株），经在Vero细胞生物反应器培养收获病毒，结合灭活疫苗生产工艺制备而成。该疫苗主要通过注射途径用于儿童预防脊髓灰质炎病毒的感染，它的上市将对我国彻底消灭脊髓灰质炎发挥至关重要的作用。