甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留蛋白含量检测方法的研究

建立甲型肝炎灭活疫苗制品中Vero细胞残留蛋白含量测定方法。制备Vero细胞蛋白抗原,免疫家兔制备抗血清,提取纯化抗血清IgG并以酶标记,建立酶联免疫吸附法检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果显示兔抗IgG效价为1:32,通过Western blot表明兔抗IgG与Vero细胞蛋白抗原能特异性结合;通过方阵试验确定抗体包被浓度为1:400,酶标抗体工作浓度为1:200～1:400,抗原参考品检测范围为25～800ng/ml,线性关系良好,r=0.995,该试剂特异性、精密度及准确度良好,稳定性试验证明在4℃可保存半年。建立了酶联免疫吸附法,可用于甲型肝炎灭活疫苗中Vero细胞残留蛋白含量的检测。

质谱技术在单克隆抗体类药物宿主细胞残留蛋白检测中的应用进展

单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物,以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白(HCP)是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质,HCP含量测定是单抗药物质量控制中重要的一项指标。酶联免疫法(ELISA)是目前HCP检测最常用的方法,可以定量检测HCP的总量,但存在局限性。而质谱法作为一种高精密度高准确性的检测方法,已被应用于单克隆抗体类生物药物生产工艺中HCP的监测,可以与ELISA形成互补,弥补ELISA方法存在的不足,为生产条件优化、纯化效果验证提供了依据。文中将从样品前处理技术、分离技术以及数据采集技术3个方面介绍近年来质谱技术在单克隆抗体类药物HCP研究中的应用与进展,为后续质谱法应用于HCP检测研究提供了参考和指导。

人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量的测定

用硫酸鱼精蛋白可去除 vero细胞狂犬病疫苗中残存的细胞基质 DNA,使其残余量小于 10 0 pg/剂量 ,但经一系列处理后的疫苗中硫酸鱼精蛋白应无残留 ,方认为安全可靠。我们采用毛细管电泳法 ,检测该种疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量 ,在待检样品中硫酸鱼精蛋白未检出 ,该方法最小检出量为 3ppm。

SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的 克隆表达SARS CoVS1蛋白 ,构建SARS基因疫苗。方法 从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS CoVS1蛋白的编码序列 ,将该序列克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。采用脂质体法转染VeroE6细胞 ,用Westernblot检测S1蛋白的表达。结果 PCR方法扩增出 2 0 0 0bp左右的基因片段 ,插入pVAX1构建重组表达载体后 ,经序列测定证实扩增的片段为SARS CoVTor 2株S1蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞 ,收集细胞总蛋白 ,Western检测获得特异蛋白带。结论 成功克隆并表达了SARS CoVS1蛋白 。

汉坦病毒感染体外诱导VeroE6细胞热休克蛋白的表达

目的 研究汉坦病毒 (HTV)感染后对细胞应激基因表达的影响 .方法 用 HTV感染其敏感细胞株 Vero E6细胞 ,用 Western印迹杂交、RNA斑点杂交及原位杂交分别分析热休克蛋白 (HSP)的表达及编码 HSP的 m RNA水平的变化 .结果 病毒感染后细胞内 HSP70及热休克蛋白 m RNA水平均有增高 ,而 HSP6 5及 HSP2 7的表达则无明显改变 .结论 HTV感染可以直接诱导 HSP70的高表达 。

酶标法相对定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白

目的 建立定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白 (hostcellprotein ,HCP)的方法 ,并用该方法检测Vero细胞乙脑疫苗中HCP含量。方法 模拟Vero细胞疫苗生产工艺 ,制备Vero细胞HCP及其免疫血清 ,经过DEAEProteinASepharoseCL -4B亲和层析 ,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG。通过对检测条件的优化 ,确立了酶标法相对定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白的方法 ,并用该方法对Vero细胞乙脑疫苗的收获物、中间产品及纯化样品收样前杂蛋白中HCP进行定量分析。结果 该方法可以检测Vero细胞疫苗加入保护剂前任何阶段产品中HCP含量。结论 ELISA法可以相对定量检测Vero细胞HCP的含量。

禽偏肺病毒感染Vero细胞的外泌体蛋白质组学分析

为研究C型禽偏肺病毒(aMPV/C)感染Vero细胞后外泌体中蛋白质组分的变化,试验收集感染病毒后48 h的细胞培养液,用超速离心法分离外泌体。经透射电镜观察、纳米颗粒跟踪技术分析、蛋白质印迹法(Western blot)鉴定后,对外泌体进行示踪试验。利用非标记定量液相色谱-质谱联用(lable-free LC-MS/MS)技术和生物信息学方法分析外泌体的蛋白质组分。结果显示:分离的外泌体为杯状双层膜囊泡,具有特征性膜蛋白CD63、CD81、Tsg101,能够进入未感染的Vero细胞;aMPV/C感染组中170个蛋白表达上调,11个蛋白表达下调;差异表达蛋白大多来源于细胞器和细胞膜,主要参与细胞过程、生物调节、代谢过程等生物学过程,执行受体结合、酶催化、分子调节等功能,集中于内吞作用、病毒感染、细胞衰老等通路。研究表明,aMPV/C感染使Vero细胞外泌体蛋白质组分发生明显变化,差异表达蛋白主要集中于细胞膜信号传导通路、病毒感染相关信号通路、细胞增殖相关信号通路,被aMPV/C感染的Vero细胞能以外泌体形式向未感染细胞进行物质或信息传递。

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。

表达绿荧光蛋白的多药耐药微小残留白血病细胞的小鼠模型

为了方便研究多药耐药微小残留白血病的病理生理和治疗,采用携带绿荧光蛋白(EGFP)基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCRG和DBA小鼠建立一个检测多药耐药微小残留白血病的动物模型。结果显示,P388/VCRG细胞腹腔接种DBA小鼠,白血病的发病率为100%,无自发缓解。P388/VCRG白血病模型小鼠对环磷酰胺(Cy)敏感,有较好的药物剂量生存时间关系,接种细胞的对数与Cy剂量间有良好回归相关关系。白血病诱导缓解后残留白血病细胞在肝、脾、胸腺及骨髓等脏器呈不均匀分布。冰冻切片荧光显微镜下观察EGFP+细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞最敏感的方法。结论:采用P388/VCRG细胞和DBA小鼠可建立表达EGFP的多药耐药小鼠微小残留白血病模型。

甲基硝基亚硝胍处理的vero细胞中磷酸化蛋白的差异显示

目的：初步了解哺乳类细胞非定标性突变形成是否与以蛋白质磷酸化级联反应为主要形式的细胞信号传导通路有关；方法：采用［３２Ｐ］体内预标记及凝胶双向电泳方法差异显示甲基硝基亚硝胍（ＭＮＮＧ）处理组和对照组磷酸化蛋白，蛋白质免疫印迹杂交试验初步鉴定差异显示蛋白斑点性质；结果：在处理组发现两个与对照组不同的蛋白斑点，分子量分别在６８×１０３和４３×１０３附近，与抗酪氨酸磷酸化蛋白抗体未发生阳性反应；结论：根据差异显示蛋白斑点的分子量和印迹杂交试验结果，初步认为所见蛋白斑点可能为丝／苏氨酸磷酸化蛋白。

Vero细胞蛋白过敏原性研究

目的 研究Vero细胞蛋白的过敏原性。方法 取不同剂量Vero细胞宿主细胞蛋白和裂解蛋白致敏豚鼠 ,隔日 1次 ,共 3次 ,每组 3只 ,以牛血清及生理盐水分别为阳性及阴性对照 ,末次致敏后 2 1d攻击 ,并观察攻击后的反应。结果 攻击后 30min ,10 0ng 只以上剂量组均出现过敏反应 ,且反应强度与剂量呈正相关。 2 4h各剂量组过敏反应的恢复情况各不相同。结论 Vero细胞宿主细胞蛋白及裂解蛋白均可以引起过敏反应 ,裂解蛋白的反应强度高于宿主细胞蛋白。

硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙脑疫苗残余DNA方法的条件优化

Vero细胞规模化生产疫苗时利用硫酸鱼精蛋白可去除乙型脑炎纯化疫苗中Vero细胞的DNA,实验中对不同条件进行了比较.首先在Vero细胞冻融浓缩液中分别按终浓度2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml加入鱼精蛋白去除DNA,确定0.2～2 mg/ml均有良好去除效果;其次将Vero细胞培养的乙脑病毒浓缩液分3组:第1组按2mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml分别沉淀一次、两次;第2组加入终浓度1mg/ml PS后调pH值为pH6.0、6.4、6.8、7.2、7.6;第3组将NaCl浓度调整至0.029mol/L、0.145mol/L、0.725mol/L,加入终浓度1mg/mlPS.确定低浓度多次沉淀、pH值6.8～7.2、盐浓度0.145mol/L条件下沉淀效果最好.

SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究

目的:探讨SARS冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)与钙调蛋白结合肽(calmodulinbindingpeptide,CBP)-蛋白A串连亲和纯化(tandemaffinitypurification,TAP)标签在Vero细胞内的融合表达及亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。方法:从质粒pGEM-4Z-S中扩增S片段,在5'端加入Kozak序列,并与TAP标签基因共同插入pcDNA3.1(-)中,构建出真核表达载体pcDNA3.1-S-TAP(C)。将构建好的质粒瞬时转染Vero细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光及Western-blotting技术检测融合蛋白的表达及亚细胞定位。结果:成功构建出真核表达载体pcD-NA3.1-S-TAP(C),瞬时转染Vero细胞后S-CBP-蛋白A融合蛋白[S-TAP(C)]得到表达,重组痘苗病毒vTF7-3可有效增强该融合蛋白的表达水平,且检测到S-TAP(C)融合蛋白表达于细胞膜上。结论:S蛋白与TAP标签融合蛋白表达于细胞膜上,且vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。

稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的建立

旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293V细胞,包装表达ASFV-P54蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染Vero细胞,筛选出一株稳定表达ASFV-P54蛋白的Vero细胞系,命名为Vero-AG-ASFV-P54。间接免疫荧光试验表明,该细胞系能够与P54多克隆抗体反应;经波兰国家兽医研究所进一步验证,结果显示,该细胞系与ASFV抗体阳性血清也能发生反应,并且与阴性血清无反应。结果表明,Vero-AG-ASFV-P54细胞系能够稳定高效的表达具有生物活性的ASFV-P54蛋白。

Vero细胞疫苗生产过程中宿主细胞蛋白含量分析

目的了解Vero细胞疫苗中间产品中宿主细胞蛋白(Host cell protein,HCP)的含量变化。方法模拟Vero细胞疫苗生产工艺流程,制备Vero细胞HCP,免疫家兔制备Vero细胞HCP免疫血清,经Protein ASepharose CL-4B亲和层析,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG,通过SDS-PAGE和Western blot分析Vero细胞乙型脑炎疫苗及Vero细胞SARS疫苗各中间产品的蛋白、HCP及病毒抗原成分的含量变化。结果Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗中间产品中均存在一定量HCP,不同的纯化工艺均可以去除大部分HCP,随着生产工艺的进行,疫苗中间产品中HCP的含量逐渐降低,病毒成分的纯度逐渐增高,但纯化后产品中仍存在少量HCP。结论Vero细胞乙型脑炎疫苗和Vero细胞SARS疫苗均存在一定量HCP。

半胱氨酸蛋白酶8相关蛋白2及微小残留病灶的联合检测在儿童急性淋巴细胞白血病中的预后意义

目的研究急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿初诊骨髓样本中半胱氨酸蛋白酶8相关蛋白2(CASP8AP2)的表达水平及其临床意义。方法 2008年4月至2009年8月,首都医科大学附属北京儿童医院收治的初发儿童ALL为研究对象,使用RQ-PCR方法检测初诊骨髓样本中CASP8AP2的表达水平。根据ROC曲线界值将CASP8AP2水平分为高表达组和低表达组;以第33天微小残留病灶(MRD)水平分为MRD高表达和低表达组;以CASP8AP2联合第33天MRD表达水平分为高危组、中危组和低危组。分析CASP8AP2、MRD以及两者联合对预后判断的价值。结果 81例ALL患儿纳入分析,男女比例1.6∶1。①复发组CASP8AP2表达显著低于非复发组,(0.45±0.31)vs(0.77±0.35),P=0.0021;CASP8AP2高表达和低表达组的复发率分别为3.2%(2/62)和42.1%(8/19),差异有统计学意义(P<0.001),ROC曲线下面积(AUC)为0.851,95%CI:0.700～1.002。②MRD高表达组和低表达组复发率分别为23.7%(9/38)和2.3%(1/43),差异有统计学意义。ROC曲线分析显示,AUC为0.890,95%CI:0.773～1.007。③CASP8AP2-MRD低危组37例无复发,中危组2/31例(6.4%)复发,高危组8/13例(6.2%)复发,差异有统计学意义(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,CASP8AP2-MRD高危组的无事件生存时间及总生存时间显著低于中危组和低危组。ROC曲线分析显示,AUC为0.917,95%CI:0.837～0.997。结论 CASP8AP2的表达水平结合MRD可准确的判断儿童ALL的预后。

不同方法测定基因工程药物中中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留量的比较与分析

目的对不同中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞蛋白检测试剂盒进行比较分析以确定最佳检测方法。方法用4种不同的CHO细胞蛋白检测试剂对 32批用CHO细胞表达的基因工程产品原液进行检测 ;用标准品替换方法分析 3批红细胞生成素供试品 ;并对 2种CHO细胞蛋白标准品和 4种供试品进行SDS PAGE分析。结果不同的检测方法之间的结果存在较大的偏差 ;同一检测试剂盒替换标准品后测得结果有较大差异 ;标准品的组成成分和比例存在较大差异。

串联型黄色荧光蛋白在Vero细胞中的表达

试验旨在探索串联型黄色荧光蛋白(YFP)在真核细胞中的表达,以便于构建用于球虫转基因研究的载体。用PCR方法克隆了不含鼠鸟氨酸脱羧酶PEST序列的目的DNA片段YFP-1和YFP-2,并将其依次连接于原始载体pd2EYFP-N1以替换d2EYFP报告基因,将重组载体电转染Vero细胞,观察荧光情况。结果显示,重组载体pYFP-YFP-N1能够在Vero细胞中正常表达,串联型YFP基因可用于球虫转基因中载体构建。

人参水溶性蛋白对Vero细胞增殖影响的研究

采用MTT法测定不同浓度人参水溶性蛋白对非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖的影响。研究表明,人参水溶性蛋白对Vero细胞增殖具有抑制作用(P<0.001)。

地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究

重组白细胞抑制因子一水蛭肽嵌合蛋白（recombinantneutrphilinhibitoryfactorandhiruloghybrid，TNHH）是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，