传染性法氏囊病病毒疫苗株B87在DF-1细胞和Vero细胞感染性研究

为比较传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗株B87对DF-1细胞和Vero细胞易感性,对比了IBDV B87株感染两种细胞后的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒基因组dsRNA、半数组织感染量(median tissue culture infective dose,TCID 50)水平、病毒载量及VP2基因表达水平。结果显示,IBDV B87株感染后,DF-1细胞CPE程度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒基因dsRNA荧光密度高于Vero细胞;DF-1细胞病毒载量荧光密度高于Vero细胞,且DF-1细胞中病毒滴度(105.423±0.03296 TCID 50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428 TCID 50/0.1 mL,P<0.01),VP2基因表达量显著高于Vero细胞(P<0.05)。说明IBDV B87株对DF-1细胞的感染性高于Vero细胞。

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应传代研究

本文报导了用我国狂犬病毒固定毒人二倍体细胞适应株（ＣＴＮ－１）进行Ｖｅｒｏ细胞适应传代研究。通过连续传代培养，滴度可达８．０ｌｏｇＬＤ_（５０）ｍｌ，达到了ＷＨＯ规定的不需浓缩的标准。病毒用０．０１ＭＯＩ感染细胞其产量与１Ｍｏｌ感染量相仿。病毒增殖高峰在４－５天，维持达１５天无明显下降，且可连续收获４－５次。因此，该毒种符合ＷＨＯ提出的疫苗生产毒种要求，可用于狂犬病疫苗生产。

传染性法氏囊病病毒弱毒株对Vero细胞的适应性研究

传染性法氏囊病病毒疫苗的传统生产工艺是利用鸡胚成纤维细胞增殖 IBDV,但易被外源病原污染 ,且生产成本很高 .借鉴国内外流行性乙型脑炎疫苗生产的经验 ,使用 Vero细胞增殖 IBDV弱毒株 ,从病毒高峰出现时间、滴度峰值的高低、对细胞代谢的影响等方面研究了 IBDV对 Vero细胞的适应性、敏感性以及适应后的种毒的长期保存过程中发现病毒滴度有下降趋势 ,试用了不同试剂对病毒进行保护 .

基于鸡传染性支气管炎病毒Vero细胞适应株全病毒抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为了对鸡传染性支气管炎(IB)疫苗的免疫效果进行有效评估,研究以QX型IBV的Vero细胞适应株为包被抗原,对检测条件进行优化,建立了IBV抗体间接ELISA检测方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为160μg/mL,最佳包被条件为37℃、2 h,封闭条件为5%脱脂奶粉、37℃封闭2 h,最佳抗体稀释液选择2%脱脂奶,一抗的最佳反应条件为37℃、60 min,二抗的最佳稀释度为1∶10000,作用时间为60 min,底物显色时间为15 min;特异性、重复性试验证明,该方法与其他病原无交叉反应,特异性好,批内、批间变异系数较低,重复性好。研究初步建立了IBV抗体间接ELISA检测方法,可应用于免疫鸡群后抗体水平监测及早期感染预警。

狂犬病病毒Vero细胞适应株的建立及其应用于疫苗生产的可行性探讨

将狂犬病病毒７ａＧ固定毒适应于Ｖｅｒｏ细胞，建立了稳定的ＶＲＧ适应株。病毒滴度可达７．６９ｌｏｇＬＤ５０／ｍｌ，病毒最适增殖时间５—７天，最适种毒比例１：１０￣３。应用转瓶培养Ｖｅｒｏ细胞增殖病毒，收获病毒液经β—丙内脂灭活，超离浓缩制备疫苗，效力试验结果（ＮＩＨ法）较原制疫苗成倍增高，且都大于２．５ＩＵ／２ｍｌ，表明ＶＲＧ适应株可应用于制备Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗。

肾综合征出血热病毒Z10株在Vero细胞上传代适应和增殖动态

目的为了肾综合征出血热病毒滴度达到规模化生产要求。方法将肾综合征出血热病毒 Ｚ１０ 株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应，不同时间取样，测定病毒滴度。结果从第２代即可稳定达到高滴度。转瓶培养比静 止培养的病毒峰值出现的更早，第 ４ ｄ即可达到１０８／ｍｌ以上，且可多次收液。结论初步确立了疫苗生产中病毒制 备工艺。

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。

肾综合征出血热病毒LR1株在Vero细胞上适应的特性研究

选取不同代次的ＬＲ１毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应，不同天数连续动态观察细胞病变情况，同时用免疫荧光法和ＥＬＩＳＡ进行抗原检测，收毒前细胞反复冻融及超声波破碎，细胞破碎前后用ＥＬＩＳＡ检测抗原含量，半微量空斑法检测病毒滴度。结果证明：ＬＲ１株病毒能在Ｖｅｒｏ细胞上产生细胞病变，病变程度与其毒力明显相关；ＬＲ１株病毒在Ｖｅｒｏ细胞上繁殖的最佳收毒时间为１１天左右；病毒释放性较差。

狂犬病毒株适应Vero细胞生产株的生物学研究

本文对狂犬病固定毒株适应Vero细胞生产株3aG-V的生物学特性进行了研究,包括毒株的形态、抗原结构、培养条件、致病性、免疫原性、纯毒试验及其在中枢神经系统是否形成尼氏小体检查。结果表明狂犬病病毒3aG-V株具有抗原性好,培养产毒量高,保持有aG固定株弱毒性、传代稳定、无变异,可作为替代地鼠肾细胞狂犬病疫苗aG毒株,用于Vero细胞培养病毒生产出毒液毒力高,灭活后效力高,安全性好的纯化Vero细胞狂犬病疫苗的生产用疫苗株。

猪流行性腹泻病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero细胞的传代适应性研究

为了解PEDV YL112株与其他不同来源PEDV毒株之间在分子生物学上的差异,对PEDV YL112株的M基因进行了扩增和序列分析。结果表明:PEDV YL112株与参考株的M基因核苷酸同源性在97.9%~99.8%之间,显示出高度保守性。系统进化树分析表明,PEDV YL112株与经典株CV777的亲缘关系较远,而与我国地方流行毒株HLJBY分离株以及HN-XYYYP-2007的亲缘关系较近。为进一步了解该毒株的复制特征,采用Vero细胞对PEDV YL112株进行体外细胞传代适应性研究。结果表明:经过连续传代培养后,PEDV YL112株对Vero细胞的适应性显著增强,其滴度从第5代的104.8 TCID50/0.1m L提高至第40代的10^(7.6) TCID_(50)/0.1m L。本研究对于分析PEDV的遗传变异规律、了解病毒的致病特征及开发新型疫苗等均具有重要理论和现实意义。

水痘-带状疱疹病毒疫苗株在Vero细胞中的传代适应

目的探索水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株在Vero细胞中的传代适应及大量制备抗原的可行性。方法以VZV疫苗株在Vero细胞中传代适应,并检测适应株的生物学性状,采用15L旋转培养瓶培养,大量制备VZV ELISA抗原,并检测抗原的特异性。结果VZV疫苗株在Vero细胞中传代至第9代时,CPE明显增多,病毒滴度从2～3logPFU/ml提高到不低于4·2logPFU/ml。所制备毒种的适宜MOI为0·01,在72h左右收获的病毒滴度较高。毒种在-70℃保存1年后,病毒滴度未显著降低。抗VZV阳性血清检测证实制备的抗原具有较好特异性,抗原最适稀释浓度为1:4000。结论VZV疫苗株在Vero细胞中能传代适应,并可用15L瓶旋转培养大量制备VZV抗原。

黄热疫苗病毒17D株在Vero细胞上的适应性传代

目的 建立黄热疫苗病毒17D株的Vero细胞适应株.方法 将2批鸡胚黄热疫苗病毒在Vero细胞上进行2次蚀斑筛选,并连续传代培养,然后对获得的4株Vero细胞适应株病毒YFV-Vero（5）-A1、YFV-Vero（5）-A2、YFV-Vero（5）-B1和YFV-Vero（5）-B2进行稳定性和免疫原性检测.结果 4株Vero细胞适应株病毒可被黄热病毒（17D）猴免疫血清中和.在传代过程中,不同代次的病毒滴度稳定在6.90LgPFU/ml以上,高峰病变出现时间为5～7 d.家兔和小鼠的免疫血清中和抗体效价分别为1：640～1：5 120和1：640～1：2 560.结论 4株Vero细胞适应株病毒生物学性状稳定,免疫原性良好.

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞上的适应传代

以我国狂犬病固定毒人二倍体细胞适应株 (CTN - 1)作Vero细胞适应传代研究。显示CTN - 1株能较好适应Vero细胞 ,经 5代培养病毒滴度可达 7 5logLD5 0 /ml,且在 5～ 2 0代以内均稳定在 7 0logLD5 0 /ml左右 。

甲型肝炎病毒Vero细胞适应株的选育研究

将甲肝患者粪便中分离的甲型肝炎病毒在Vero细胞中进行适应性培养 ,选育高滴度适应株应用于甲肝灭活疫苗研究。在Vero细胞上连续传代 ,测抗原滴度和感染性滴度 ,满意后按WHO推荐的甲型肝炎灭活疫苗规程进行灭活疫苗试制研究。经Vero细胞 14次适应性传代后 ,病毒抗原滴度可高达 1∶2 5 6 0 ,感染性滴度为 8.2 3LogC CID50 /ml。试制的灭活疫苗HPSEC检测在 2 80nm时仅有一个高峰 ,SDS PAGE电泳 ,在 2 2kD、2 6kD和 33kD处有三条蛋白带 ,和HAVVP3、VP2和VP1的位置相同。ICR小鼠效力试验表明疫苗剂量 16 0 0EU/ml与Merck疫苗5 0U效果相似。通过研究获得了Vero细胞甲肝病毒适应株YN5株 ,初步证明可作为甲型肝炎灭活疫苗的候选毒株。

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础。方法优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析。结果在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性。结论WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低。

狂犬病毒地鼠肾细胞适应株的选育

将aG株豚鼠脑组织毒种于原代地鼠肾细胞传代适应后，优选出一株感染地鼠肾细胞增殖滴度高，稳定性好并保持原株抗原性的新的适应株，其生物学性状和免疫原性研究结果表明，将有可能取代豚鼠脑毒种，生产出更为安全、有效的狂犬病疫苗。

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。

流行性乙型脑炎病毒在Vero细胞上传代适应的研究

通过乙脑病毒Ｐ＿３株以不同方式在鼠脑和Ｖｃｒｏ细胞间传代适应的研究，培育出适于工业化大生产制备乙脑疫苗的生产毒种。其毒力可达７．０±０．５ｌｇＬＤ５０／０．０４ｍｌ，空斑滴度为７．５±０．５ＰＦＵ／ｍｌ，免疫原性ＩＤ５０值为０．００００１６－０．００００２３ｍｌ；在含有适量人白蛋白的１９９营养液内，该毒种于－３０℃至少可稳定一年；与鼠脑组织毒种相比，传代细胞毒种的毒力、免疫原性及稳定性均与其相当。然而，后者不含脑组织，至少降低了一种过敏的危险。另外，细胞毒种的制备无需手工解剖鼠脑，易于控制外源因子污染，易于标准化。对于大规模生产疫苗、提高疫苗产量和质量，传代细胞毒种比鼠脑组织悬液毒种具有明显的优点。

肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株在Vero细胞上的适应传代及其抗原性研究

〔目的〕将肾综合征出血热疫苗后备毒株适应于Vero细胞 ,观察病变情况 ,并对其抗原性和繁殖特性进行研究。〔方法〕将新分离的汉坦病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株在Vero细胞上进行连续传代 ,采用间接免疫荧光法(IFA)、反向被动血凝试验 (RPHA) ,研究传代后毒株的病毒滴度、抗原量以及细胞的病变情况 ,同时将传代后的病毒接种敏感动物 ,观察动物的发病情况和毒株的繁殖特性。〔结果〕经过 5次连续传代 ,四株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性 ,从第二代开始病毒滴度稳定在 6.0 0LgTCID5 0 ml以上 ,第五代时最高达 7.5 0LgTCID5 0 ml ,第三代毒株抗原量均已达到 1:12 8,ZJ7株抗原量最高时达 1:768,四株毒株感染Vero细胞 ,连续观察 12d不见细胞产生病变 ,第五代细胞病毒液接种敏感动物 ,9d后动物发病甚至死亡。〔结论〕四株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。

HFRS病毒Z_(37)株在绿猴肾传代细胞的病变作用和传代适应

〔目的〕研究肾综合征出血热 (HFRS)病毒Z3 7疫苗株在绿猴肾传代细胞 (vero ,vero -E6)上的病变和传代适应增殖情况 ,为应用vero细胞研制出血热疫苗提供科学依据。〔方法〕将肾综合征出血热疫苗株Z3 7适应在绿猴肾传代细胞 (vero ,vero-E6)上 ,对细胞进行细胞病变 (CPE)的动态观察 ,并于不同的时间取样 ,测定病毒滴度 ,比较静置培养、转瓶培养滴度的差异情况。〔结果〕Z3 7株不使vero -E6细胞产生病变 ,用HEPES诱导 ,3d可见明显病变现象。Z3 7株不使vero细胞产生病变 ,用HEPES诱导病变现象未获成功 ,Z3 7株在vero细胞中可高滴度繁殖 ,滴度达到 10 7/ml,转瓶培养病毒滴度略高于静置培养。