地高辛标记探针检测Vero细胞狂犬病疫苗残余Vero细胞DNA含量

地高辛标记Vero细胞DNA ,并制备成DNA探针。以此探针进行点杂交 ,确定探针的工作浓度、特异性及灵敏度。并用此法监测Vero细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化工艺的Vero细胞DNA去除率 ,测定精制Vero细胞狂犬病疫苗半成品中残余Vero细胞DNA含量。结果表明 ,该法特异性强 ,重复性好 ,快速简便 ,灵敏度高 ,检测值可达 5pg/剂量 ,可用于精制Vero细胞狂犬病疫苗纯化工艺的质量控制和半成品检定。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测法。方法用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.0030~300.0000pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.0030pg/μl;精密度良好(相对标准偏差<15%);反应体系配制好后置于2~8℃30min后进行检测,相对标准偏差<15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1pg/μl。结论qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。

硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙脑疫苗残余DNA方法的条件优化

Vero细胞规模化生产疫苗时利用硫酸鱼精蛋白可去除乙型脑炎纯化疫苗中Vero细胞的DNA,实验中对不同条件进行了比较.首先在Vero细胞冻融浓缩液中分别按终浓度2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml加入鱼精蛋白去除DNA,确定0.2～2 mg/ml均有良好去除效果;其次将Vero细胞培养的乙脑病毒浓缩液分3组:第1组按2mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml分别沉淀一次、两次;第2组加入终浓度1mg/ml PS后调pH值为pH6.0、6.4、6.8、7.2、7.6;第3组将NaCl浓度调整至0.029mol/L、0.145mol/L、0.725mol/L,加入终浓度1mg/mlPS.确定低浓度多次沉淀、pH值6.8～7.2、盐浓度0.145mol/L条件下沉淀效果最好.

2种去除Vero细胞DNA工艺的研究

目的建立并比较2种去除Sabin株脊髓灰质炎疫苗Vero细胞DNA工艺方法。方法采用不同终浓度的鱼精蛋白和非限制性核酸内切酶在不同条件下分别处理Sabin株脊髓灰质炎病毒浓缩液,采用荧光染色法检测宿主细胞DNA、酶联免疫法检测D抗原和宿主残余蛋白含量。结果鱼精蛋白的终浓度为1 g/L^1.5 g/L,病毒浓缩液中Vero细胞DNA的去除率达98%以上,抗原回收率达85%以上,宿主细胞残余蛋白去除率可达30%左右;非限制性核酸内切酶的终浓度为100 U/ml^150 U/ml,37℃孵育2 h转入2℃~8℃孵育18 h^20 h,病毒浓缩液中Vero细胞DNA的去除率达95%以上,抗原回收率达98%以上,宿主细胞残余蛋白基本无去除。结论 2种工艺均可用于去除Sabin株脊髓灰质炎疫苗中Vero细胞残余DNA,非限制性核酸内切酶法操作更简便快捷。

Sartobind Q膜纯化乙型脑炎灭活疫苗的研究

目的:提供一种应用Sartobind Q膜去除乙脑灭活疫苗中细胞残留DNA的方法。方法:使用传统的Sepharose 6 Fast Flow层析所获得的初步纯化液进行Sartobind Q膜层析,在一定的离子强度和pH下,使DNA吸附在Sartobind Q膜的配基上,而病毒蛋白不吸附直接从膜下流出,得到最终纯化液,通过抗原含量和宿主细胞残留DNA的含量评价纯化结果。结果:用Sartobind Q膜处理后疫苗残留DNA比初步纯化液减少95.4%~97.8%,而且病毒抗原含量无显著变化。结论:Sartobind Q膜可吸附乙脑疫苗中Vero细胞DNA残留,进一步降低疫苗杂质含量。

应用复合纯化介质Capto Core700纯化狂犬病疫苗

目的应用复合凝胶Capto Core700作为纯化介质去除狂犬病疫苗中的Vero细胞宿主蛋白和宿主细胞DNA等杂质。方法将Vero细胞接种至微载体,在celligen plus生物反应器中培养,按MOI=0.002接种狂犬病病毒,连续制备10批狂犬病疫苗原液。经过滤及浓缩后加入β-丙内酯,于2~8℃灭活24 h,获得病毒灭活液。上样至装载复合凝胶Capto Core700的纯化柱进行层析纯化,并按《中国药典》三部(2015版)的方法检测宿主细胞蛋白去除率、宿主细胞DNA去除率、狂犬病病毒糖蛋白回收率及总蛋白去除率。同时与传统Sepharose系列凝胶纯化方法进行比较。结果 10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为58.3%~63.2%,宿主细胞DNA去除率均>90%,糖蛋白回收率范围为52.3%~74.5%,蛋白去除率范围为7.22%~11.76%。与传统Sepharose系列凝胶纯化方法比较,差异较小,且Capto Core700的上样量为3倍柱体积,高于Sepharose凝胶(15%)。结论 Capto Core700凝胶可有效去除狂犬病疫苗中的杂质,缩短了纯化工艺时间。