斑点杂交法测定Vero细胞DNA残留量的探针选择

目的:为精确检测以Vero细胞为基质的生物制品中宿主细胞残余DNA含量。方法:将提取的Vero细胞DNA分别用不同时间的超声波和 HindⅢ内切酶进行断链处理,电泳和序列分析并确定DNA片段长度,地高辛标记后制备成检测探针,测定已知的不同浓度的样品DNA和疫苗中DNA残留量。结果:HindⅢ内切酶处理断链后产生172 bp、344 bp、516 bp、688 bp不同长度的DNA,并选取172bp长度的DNA片断和超声波处理30 s的DNA长度为500～750 bp的DNA片断作为检测用探针。结论:两种方法处理的DNA探针检测DNA的灵敏度可达0.1 pg,重复性均较好,超声波处理的探针特异性优于酶切探针,并能成功的应用于疫苗产品中残余宿主细胞DNA的检测。

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测法。方法用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.0030~300.0000pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.0030pg/μl;精密度良好(相对标准偏差<15%);反应体系配制好后置于2~8℃30min后进行检测,相对标准偏差<15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1pg/μl。结论qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。

基于循环肿瘤DNA的分子残留病灶检测及其在非小细胞肺癌术后中的应用价值

肺癌仍是我国乃至全世界发病率、病死率较高的恶性肿瘤之一,其中主要以非小细胞肺癌(NSCLC)为主。目前以手术为主的综合治疗仍是早中期及局部晚期的NSCLC的标准治疗方法,但仍有很多ⅠA~ⅢA期病人在根治性治疗后复发。因此临床上对精准的根治性手术治疗后的监测手段和辅助治疗的评估方法有强烈的需求,以达到根除分子残留病灶(MRD)。随着检测技术的进步,循环肿瘤DNA(ctDNA)作为提示MRD的分子指标逐步走向临床。最新共识提出在将围手术期NSCLC病人外周血中可稳定检测出的ctDNA作为MRD的检测指标。MRD的应用使得对NSCLC根治术后进行疾病监测、以判断预后和更早地发现肿瘤复发成为可能。在早中期及局部晚期的NSCLC病人术后辅助治疗研究中,不同的研究结果表明术后辅助治疗的疗效及判断是否需要行术后辅助治疗的标准存在争议。MRD可以作为一个更精准的预测指标,有望对术后辅助治疗进行指导,并为精准的个体化辅助治疗方案的制定提供依据,从而使病人能在疾病治疗中获益。

基于ctDNA的分子残留病灶检测对非小细胞肺癌根治术后生存的预测效能

目的探讨基于循环肿瘤DNA(ctDNA)的分子残留病灶(MRD)检测对非小细胞肺癌(NSCLC)患者根治术后近远期生存的预测效能。方法选取重庆医科大学附属第一医院胸外科行根治术治疗的114例NSCLC患者为研究对象,于术后1周采集患者静脉血,采用液态活检和二代测序技术检测ctDNA MRD。统计患者术后MRD阳性率,并分析其与临床病理特征的关系。记录患者术后1年、5年生存情况,采用Kaplan-Meier生存曲线比较MRD阳性和阴性患者的近远期生存率,采用Cox回归模型分析NSCLC根治术后近远期生存的影响因素,分析MRD检测对NSCLC根治术后近远期生存的预测效能。结果NSCLC患者术后MRD阳性率为36.84%,低/未分化、肿瘤直径>3 cm、纵隔淋巴结转移、TNM分期ⅢA期的NSCLC患者MRD阳性率分别高于高/中分化、肿瘤直径≤3 cm、无纵隔淋巴结转移、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。NSCLC患者术后1年、5年生存率分别为83.33%、52.63%,MRD阳性患者近远期生存率均低于MRD阴性患者(P<0.001)。低/未分化、肿瘤直径>3 cm、TNM分期ⅢA期、术后MRD阳性均是影响NSCLC根治术后患者近远期生存的危险因素(P<0.05),而纵隔淋巴结转移是影响NSCLC根治术后患者远期生存的危险因素(P<0.05)。术后MRD预测NSCLC患者根治术后近期生存的灵敏度、特异度、准确度分别为73.68%、89.47%、76.32%,预测远期生存的灵敏度、特异度、准确度分别为95.00%、72.22%、84.21%。结论NSCLC患者MRD阳性率与肿瘤分化程度、TNM分期、肿瘤大小等有关,是影响NSCLC根治术后近远期生存的危险因素,且对近远期生存预测具有重要价值。

循环肿瘤DNA在非小细胞肺癌中的应用进展

肺部恶性肿瘤在全球范围内属于发病率与致死率最高的癌症类型,非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的大多数,大约85%。治疗NSCLC的主要策略包括手术切除、放射治疗、化学治疗、分子靶向药物治疗及免疫治疗等综合疗法。液态活检技术,因其具有非侵入性、能够实时监测肿瘤负荷,以及提供全面的肿瘤基因组信息等显著优势,在临床上应用日益广泛。特别是循环肿瘤DNA(ctDNA)作为一种理想的生物标志物,在NSCLC的诊断和治疗中扮演着关键角色。本文将深入探讨ctDNA在NSCLC中的研究进展,覆盖预后评估、复发监控及治疗反应预测等多个领域。

甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定vero细胞DNA体外复制的保真度

利用在猴肾ｖｅｒｏ细胞抽提物中建立的ＤＮＡ体外复制系统，对穿梭质粒ｐＺ１８９ＤＮＡ进行有效的复制后，将复制产物转化至Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＭ７０７０，观察ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ中突变靶基因ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变的情况．在烷化剂甲基硝基亚硝基胍（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ′－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）诱发的遗传不稳定（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ｖｅｒｏ细胞胞浆抽提物中进行ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ复制，发现经过体外复制的ｐＺ１８９质粒中ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变率高出对照组５－８倍（Ｐ＜０．０５）。

硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙脑疫苗残余DNA方法的条件优化

Vero细胞规模化生产疫苗时利用硫酸鱼精蛋白可去除乙型脑炎纯化疫苗中Vero细胞的DNA,实验中对不同条件进行了比较.首先在Vero细胞冻融浓缩液中分别按终浓度2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml加入鱼精蛋白去除DNA,确定0.2～2 mg/ml均有良好去除效果;其次将Vero细胞培养的乙脑病毒浓缩液分3组:第1组按2mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml分别沉淀一次、两次;第2组加入终浓度1mg/ml PS后调pH值为pH6.0、6.4、6.8、7.2、7.6;第3组将NaCl浓度调整至0.029mol/L、0.145mol/L、0.725mol/L,加入终浓度1mg/mlPS.确定低浓度多次沉淀、pH值6.8～7.2、盐浓度0.145mol/L条件下沉淀效果最好.

地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究

重组白细胞抑制因子一水蛭肽嵌合蛋白（recombinantneutrphilinhibitoryfactorandhiruloghybrid，TNHH）是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，

地高辛标记探针检测Vero细胞狂犬病疫苗残余Vero细胞DNA含量

地高辛标记Vero细胞DNA ,并制备成DNA探针。以此探针进行点杂交 ,确定探针的工作浓度、特异性及灵敏度。并用此法监测Vero细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化工艺的Vero细胞DNA去除率 ,测定精制Vero细胞狂犬病疫苗半成品中残余Vero细胞DNA含量。结果表明 ,该法特异性强 ,重复性好 ,快速简便 ,灵敏度高 ,检测值可达 5pg/剂量 ,可用于精制Vero细胞狂犬病疫苗纯化工艺的质量控制和半成品检定。

循环肿瘤DNA和循环肿瘤细胞检测乳腺癌微小残留病灶的研究

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,20%~30%的病人面临复发及转移的风险。微小残留病灶被认为是乳腺癌病程进展的重要因素之一,与不良预后有密切关系。目前微小残留病灶的检测主要依靠液体活检,包括循环肿瘤DNA及循环肿瘤细胞的检测。本文主要探讨乳腺癌微小残留病灶的检测方法,及其在预后评估、复发监测以及疗效评估中的应用。

HPV DNA检测、HPV E6/E7 mRNA检测和液基薄层细胞学检查对宫颈切除术后病灶残留或复发的预测价值

目的分析对比人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)DNA检测、HPV E6/E7 mRNA检测和液基薄层细胞学检查(thinprep cytologic test,TCT)在宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)3+术后病变残留或复发的临床应用价值。方法选取2017年4月至2019年8月在宜宾市第二人民医院妇科手术治疗的530例宫颈CIN3+患者作为研究对象,术后对患者每3个月随访1次,共随访4次,建立随访档案。以HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测和TCT作为随访监测指标,任一项指标异常即转诊阴道镜并行活检病理诊断,评估其对患者术后病灶残留或复发的随访价值。统计学方法采用t检验、χ^(2)检验。结果530例行宫颈切除术治疗的CIN3+患者随访1年,累计行阴道镜/活检的患者共114例,累计发现病灶残留/复发共计18例,残留/复发比例为5.7%(18/316)。手术后3、6、9、12个月,HPV E6/E7 mRNA检测阴性率分别为83.5%(264/316)、91.1%(288/316)、96.8%(306/316)、96.5%(305/316),TCT检测阴性率分别为97.2%(307/316)、97.2%(307/316)、98.7%(312/316)、99.1%(313/316),HPV DNA检测阴性率分别为53.2%(168/316)、72.8%(230/316)、81.0%(256/316)、85.4%(270/316),HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA检测阴性率呈逐渐升高趋势。HPV E6/E7 mRNA检测联合TCT预测宫颈术后病变复发的敏感性低于HPV DNA检测联合TCT[44.4%(8/18)与55.6%(10/18)],但特异性[94.8%(91/96)]和阳性预测值[61.5%(8/13)]均高于HPV DNA检测联合TCT[89.6%(86/98)与50.0%(10/20)],差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论HPV E6/E7 mRNA检测联合TCT对于预测宫颈CIN3+手术治疗后复发或病灶残留的特异性和阳性预测值均较高,可用于评估宫颈高级别病变手术治疗的预后,早期发现病变风险,同时避免不必要的过度诊疗,减轻患者的焦虑和压力。

人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量的测定

用硫酸鱼精蛋白可去除 vero细胞狂犬病疫苗中残存的细胞基质 DNA,使其残余量小于 10 0 pg/剂量 ,但经一系列处理后的疫苗中硫酸鱼精蛋白应无残留 ,方认为安全可靠。我们采用毛细管电泳法 ,检测该种疫苗中硫酸鱼精蛋白残留量 ,在待检样品中硫酸鱼精蛋白未检出 ,该方法最小检出量为 3ppm。

地高辛标记探针检测Vero细胞残余DNA试验条件的改进

目前，应用地高辛标记探针检测Veto细胞残余DNA含量仍是最常用的检测方法，该方法具有特异性强、无放射污染、操作简便等特点。在实际操作中，地高辛探针的灵敏度及杂交的条件对检测结果均有很大的影响。为此，我们就提高探针灵敏度及优化杂交条件进行了摸索。

动态监测ctDNA⁃MRD预测局部晚期NSCLC放化疗疗效

1文献来源Pan Y,Zhang JT,Gao X,et al.Dynamic circulating tumor DNA during chemoradiotherapy predicts clinical outcomes for locally advanced non⁃small cell lung cancer patients[J].Cancer Cell,2023,41(10):1763-1773.e4.2证据水平2b。

生物制品宿主细胞残留DNA检测限定标准及方法浅析

近年来热度骤增的生物制品药物对诸多疾病疗效斐然,在药品市场中所占比重也是节节攀升。于是生物制品与之俱来的生物安全性问题被渐渐提上日程,其中宿主细胞残留DNA由于可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性,各国药品监督管理机构对其残留量有着严格的限度控制。同时,各国药典也陆续提供数种关于宿主细胞残留DNA检测经典的方法,目前以实时定量聚合酶链式反应(PCR)方法为最优,因其专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量。本文介绍了一些国内与国外监管机构出台的关于生物制品宿主细胞残留DNA检测的限定规定,并对现有的常见检测方法进行描述、总结和比较。

ctDNA在B细胞淋巴瘤中的研究进展

循环肿瘤DNA(ctDNA)是肿瘤患者体液循环中一种广泛存在的游离DNA片段,相较于肿瘤实体病灶,ctDNA具有取材方便、安全无创、信息全面等优势。ctDNA检测可应用于B细胞淋巴瘤的治疗前、治疗中和治疗后等各个阶段,在肿瘤辅助诊断、预后分层、靶向治疗、疗效评估、微小残留病灶(MRD)监测及预测复发等方面具有重要指导意义。本文主要就ctDNA在B细胞淋巴瘤中的相关检测手段、应用进展和前景展望等作一概述。

乙型肝炎病毒重组DNA转化Vero绿猴肾传代细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原

使用首尾相连的乙型肝炎双拷贝DNA重组质粒pTHBV-1,以pSV2-gpt(Eco-gpt)为选择标记基因,共转化CV-1绿猴肾非营养缺陷型细胞,用霉酚酸、黄嘌呤(MX)作选择培基,选出分泌表面抗原(HBsAg)的细胞系,但HBsAg分泌量较低,见前报告。Christman等人报告,利用二氢叶酸还原酶(dhfr)

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子宿主DNA残留的研究

目的建立及优化重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)宿主DNA残留的检测方法。方法基于固相斑点杂交原理,以rhGM-CSF的工程菌DNA为模板,制备地高辛标记的探针,用试剂盒及药典的方法处理阳性对照品,并将其与探针进行杂交,采用底物显色法和化学发光法显色,建立灵敏度较高的检测方法;运用建立的方法检测2批次rhGM-CSF原液中DNA残留量。结果样品经试剂盒处理,杂交后采用化学发光法显色灵敏度较高,可达到10 pg;2批rhGM-CSF原液每人份剂量的宿主DNA残留量均小于100 pg。结论该方法具有检测灵敏度高、准确性好、操作简便等优势,可用于rhGM-CSF原液的检测及质量控制。