Vero-2和MA-104细胞系染色体组型分析与致癌─致瘤性研究——在犬五联疫苗制备中替代BHK-21细胞系细胞株的筛选和检定

在用纯化３代的猫肾原代细胞（ＦＫＣ）和犬肾原代细胞（ＣＫＣ）皮下接种裸鼠无致癌致瘤性，以人类子宫颈癌细胞系（Ｈｅｌａ）超二倍体ＫＢ株、Ｘ株及超二倍体和亚四倍体ＮＭ２０／Ｘ株皮下接种裸鼠产生进行性恶性肿瘤比率分别为１０／１０，２５／２５和５／５的前提下，非洲绿猴肾细胞系亚二倍体（Ｖｅｒｏ２）ＪＣ株５～１９代和超二倍体ＹＡ株１２～１８代分别皮下接种２０和１０只裸鼠，均未产生肿瘤，恒河猴肾细胞系亚四倍体（ＭＡ１０４）ＪＣ株４代皮下接种５只裸鼠亦未产生肿瘤。不同株的Ｈｅｌａ和地鼠肾细胞系（ＢＨＫ２１）在３．３ｇ／Ｌ琼脂中均具有抛锚独立生长特性，并在终浓度３．１２５～２００ｍｇ／ｍＬ植物凝集素（ＰＨＡ）作用下出现凝集现象，而ＦＫＣ、ＣＫＣ及Ｖｅｒｏ２细胞系ＪＣ株、ＹＡ株既不具有抛锚独立生长特性，在不同浓度ＰＨＡ作用下也不发生凝集，符合非肿瘤源性细胞的特性。因此，Ｖｅｒｏ２细胞系ＪＣ株可用作病毒疫苗毒株的传代培养，而Ｖｅｒｏ２细胞系ＹＡ株和ＭＡ１０４细胞系ＪＣ株则不适宜。

扇贝裙边糖胺聚糖体外抗HSV-2病毒的实验研究

目的探讨扇贝裙边糖胺聚糖(SS-GAG)对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的体外抗病毒作用。方法观察病毒对宿主细胞(Vero细胞)的形态影响和毒性反应。采用噻唑蓝法检测SS-GAG对Vero细胞的毒性作用以及不同浓度SS-GAG对HSV-2的直接灭活、抑制复制活性及综合作用等。结果SS-GAG在实验浓度范围内对Vero细胞均无毒性。与病毒对照组相比,SS-GAG各浓度组(50、100、200mg/L)能有效保护经HSV-2感染的Vero细胞,使细胞活性增强(F=20.061、39.947,P<0.01),并减弱HSV-2导致的病变效应,抑制病毒的复制,但是SS-GAG对HSV-2没有直接灭活作用。结论SS-GAG在体外实验中显示出保护宿主细胞及抵抗HSV-2感染的活性作用,提示其在抗HSV-2活性方面具有进一步研究的潜力。

HSV-2 LAT ORF2在Vero细胞中的表达及对细胞的作用

旨在研究人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)对体外培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)形态和活性的作用。将构建好的带绿色荧光蛋白(EGFP)标签的HSV-2LAT ORF2真核表达载体pEGFP-ORF2,转染vero细胞,荧光显微镜观测细胞形态的改变和MTT法进行活性分析。结果:显示,HSV-2LATORF2诱导细胞形态发生明显变化,绿色荧光蛋白在细胞的定位也发生了改变,细胞活性降低。由此证实,HSV-2LAT ORF2对细胞有损伤作用,为阐明HSV-2LATORF2的功能提供了资料。

1,2-二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞损伤机理的离体试验研究

目的 了解 1,2 二氯乙烷对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 采用 0 5、1 0、2 0mmol/L 3个剂量 1,2 二氯乙烷处理非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 ) 2 4h,并运用显微荧光术测定处理后的Vero细胞内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,用比色法测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力。设立对照组。结果 接触 1 0、2 0mmol/L 1,2 二氯乙烷的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力均高于对照组 (P <0 0 1) ,而 0 5mmol/L染毒组的Vero细胞内游离Ca2 + 浓度及其上清液LDH活力与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。各剂量组的Vero细胞内ROS含量与对照组比较差异均无显著性 (P >0 0 5 )。结论 较高浓度的 1,2 二氯乙烷能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过增加细胞内游离Ca2 + 浓度。

新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)内毒素检查方法比较

目的为新型冠状病毒(简称新冠病毒)灭活疫苗(Vero细胞)的细菌内毒素检查和质量控制提供技术支持和理论基础。方法利用凝胶法、光度测定法[包括动态浊度(TKA)法、微量动态显色(mKCA)法]测定并比较新冠病毒灭活疫苗(Vero细胞)原液和成品中内毒素浓度。结果3种方法测得的供试品内毒素浓度均符合规定(原液为不超过5 EU/600 SU,成品为每剂≤5 EU),且后2种方法既能用于定性检测也能用于定量检测,特别是mKCA法下鲎试剂用量更少。结论mKCA法是检查该疫苗内毒素浓度的最适宜方法,具有灵敏度高、稳定性强、鲎试剂用量少、数据完整和可追溯、人为操作误差较小的特点。

α27基因特异性siRNA对2型单纯疱疹病毒复制的影响

目的：探讨在RNA干扰技术条件上，干扰α27基因的表达对单纯疱疹病毒（ HSV）-2复制的影响。方法体外合成针对α27基因的四对siRNA（ R1、R2、R3和R4组）和阳性、阴性对照siRNA，用Lipofectamine2000转染vero细胞后接种HSV-2，感染后分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h测定上清液病毒滴度。结果α27基因特异性siR-NA转染组在病毒复制早期（12～24 h）即出现明显的病毒滴度降低，病毒复制晚期，其病毒滴度仅稍微降低；其中，R2和R4组在病毒复制早期到晚期病毒滴度均较其它组低。结论α27基因特异性siRNA能够抑制HSV-2的复制，降低子代病毒滴度。按照同样设计原则合成的不同序列siRNA，其抑制效果存在明显差异。

2型单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表达及其对Ve-ro细胞活性的影响

目的:在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)毒力蛋白感染细胞多肽34.5(ICP34.5),并检测其对Vero细胞活性的影响。方法:PCR扩增HSV-2的ICP34.5基因,连接至pEGFP-C2载体,并对重组真核表达载体pEGFP-ICP34.5进行双酶切测序验证;将重组子瞬时转染Vero细胞,RT-PCR检测其在mRNA水平的表达,荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达,MTT法检测细胞活性。结果:经双酶切和测序验证表明pEGFP-ICP34.5构建成功,转染细胞后经RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜下观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达,MTT法检测结果证实重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用。结论:构建了pEGFP-ICP34.5真核表达载体,其能在Vero细胞中高效表达,并能抵消空质粒对细胞的损伤作用。

Inhibition of Curcumin-Treated Herpes Simplex Virus 1 and 2 in Vero Cells

The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin-treated Herpes simplex virus-1 (HSV-1) and Herpes simplex virus-2 (HSV-2) virions in cultured Vero cells. Previous studies have indicated that curcumin, a polyphenol extracted from the plant Curcuma longa, has demonstrated antiviral properties against a variety of viruses. After establishing the maximum non-cytotoxic concentrations of curcumin on Vero cells, HSV-1 and HSV-2 virions were treated with varying concentrations of curcumin. The effect on infectivity was determined by antiviral assays, using WST-1, plaque assays, adsorption and penetration assays. Treating HSV-1 and HSV-2 viruses with curcumin, at a concentration of 30 μM, reduces the production of infectious HSV-1 and HSV-2 virions in cultured Vero cells by interfering with the adsorption process. These results support the potential of curcumin to be used as a therapeutic agent to reduce the transmission of HSV-1 and HSV-2.

猪乙脑传代细胞活疫苗(SAI4-14-2株)对仔猪的安全性试验

评价以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪的安全性,将猪乙脑传代细胞活疫苗,通过1次超剂量（10倍剂量）免疫40～45日龄的仔猪,同时设立病毒液组、冻干保护剂组、空白对照组,监测仔猪体温和临床症状,采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血浆,仔猪于免疫后第14天无菌取脑组织.对采集的血样及脑组织进行蚀斑检测,并对血样及脑组织盲传3代的细胞培养液进行RT-PCR检测.结果,试验猪免疫前后临床观察、体温,免疫后接种部位均未见异常.蚀斑法和RT-PCR法检测各试验组仔猪血浆和脑组织提取液均未检出乙脑病毒.表明以Vero细胞为基质的猪乙脑传代细胞活疫苗（SA14-14-2株）对仔猪是安全的.

动物细胞系的染色体组型与遗传变异率分析

在建立国内首家犬、猫、猴、鼠传代细胞库，即７种动物肾细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２、ＭＡ－１０４、ＢＨＫ－２１）的种子库和工作库的基础上，通过细胞染色体组型、Ｇ带核型、染色体数目变异率、结构畸变率分析，了解７种细胞系传代培养不同代次的染色体变异情况。以相应的细胞株皮下接种裸鼠形成肿瘤实验、软琼脂细胞克隆形成率与植物凝集素作用下细胞凝集实验为对照，筛选出无致癌／致瘤性、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２）或极低致癌性的ＭＤＣＫ细胞系用于制苗，发现肿瘤细胞系高变异率株可在裸鼠体内快速选育成功。细胞系染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性，得到一些１００％成瘤和１００％不成瘤的细胞株并探讨了与染色体组型的关系。对于肿瘤的发病机理及实验治疗，都是非常好的模型。一些细胞系不仅成瘤而且还可转移（致恶性横纹肌样瘤的ＢＨＫ－２１和Ｖｅｒｏ细胞株），其他致瘤细胞株只成瘤不转移或不明显转移。

人α防御素-5多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用的研究

目的探讨人α防御素-5（humanα-defensin-5,HD-5）多肽体外抗单纯疱疹Ⅱ型病毒（herpes simplex virustype2,HSV-2）的作用及其机制。方法以绿猴肾细胞（Vero）为宿主细胞,采用CCK-8法首先分析10-200μg/ml浓度范围内HD-5多肽的细胞毒性,再以HSV-2感染Vero细胞,分别于感染前后和感染的同时加入100μg/ml的HD-5多肽,72h后测定细胞保护率,结合细胞病变效应观察,分析HD-5抗HSV-2的作用效果和起效环节,并通过改变培养基中血清的浓度,观察血清对HD-5抗病毒作用的影响。结果在100μg/ml浓度以内,HD-5多肽几乎无细胞毒性,提前或同时加入HD-5多肽可以显著抑制HSV-2病毒引起的细胞病变反应、提高细胞保护率（P〈0.01）,而在HSV-2感染2h后加入HD-5多肽对Vero细胞的保护作用不明显（P〉0.05）;血清浓度会显著影响HD-5多肽的抗HSV-2活性,血清浓度越高,HD-5多肽对细胞的保护率越低。结论HD-5多肽在体外具有显著的抗HSV-2感染活性,其作用机制主要是通过干扰病毒对细胞的粘附、侵入而发挥作用。

单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。

登革病毒组织培养技术

目的 :探讨对登革病毒敏感性不同的几株蚊子细胞和哺乳动物细胞的体外培养技术。方法 :对白纹伊蚊C6/3 6细胞、伪盾伊蚊Ap 61细胞和三株哺乳动物细胞LLC MK2 细胞、Vero细胞、BHK 2 1/3 1细胞进行体外培养 ,把登革病毒转染到上述细胞中 ,经传代培养后 ,在显微镜下观察。结果 :通过观察结果及时改进各细胞株的培养基的配制、消化方法和传代比例 ,各细胞株均能生长良好、单层致密、无污染 ,登革病毒转染实验呈阳性结果。结论 :实验结果证明白纹伊蚊C6/3 6细胞、Ap 61细胞、LLC MK2 细胞、Vero细胞、BHK 2 1/3 1细胞均为登革病毒敏感细胞 ,其中白纹伊蚊C6/3 6细胞敏感性较高 ,随着新的克隆细胞株的体外培养技术的成熟 ,组织培养已成为登革病毒分离。

四氯化碳对非洲绿猴肾细胞损伤机理的研究

目的 实验研究四氯化碳染毒 2 4h对非洲绿猴肾细胞的损伤及其机理。方法 运用显微荧光术测定非洲绿猴肾细胞 (Vero细胞 )内活性氧 (ROS)含量及游离Ca2 + 浓度 ,同时 ,测定Vero细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)活力用于检查Vero细胞受损情况。结果 接触浓度为 1 0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度与对照组比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,同时 ,表示Vero细胞受损指标 (LDH活力 )差异也无显著性 (P >0 .0 5 ) ;而接触浓度为 4 0、8.0mmol L四氯化碳的Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度均显著性高于对照组 (P <0 .0 1) ,其Vero细胞受损也均显著性增加 (P <0 .0 1)。结论 较高浓度的四氯化碳能损伤Vero细胞 ,其损伤的可能途径是通过提高Vero细胞内ROS含量及游离Ca2 + 浓度。

基于Vero E6细胞的抗SARS药物筛选方法的构建(英文)

目的构建基于Vero-E6细胞的抗SARS药物筛选模型。方法运用四唑氮化合物(MTS)方法,对由SARS病毒(BJ-01)引起的对Vero-E6细胞的细胞毒性作用进行检测。首先优化了实验条件(检测了MTS不同孵育时间和不同接种细胞数对测试结果的影响,并绘制了病毒滴度曲线);在检测化合物的抗病毒作用时,首先将细胞接种于96孔板中,加入待测药物和BJ-01病毒,48h后用显微镜观察细胞形态变化,96h后加入MTS和电子耦联剂(PMS)的混合溶液,在490nm检测其吸光度。结果对4000多种化合物的抗SARS病毒作用进行了检测。获得10种可能有抗SARS病毒作用的药物。结论基于Vero-E6细胞的MTS检测方法提供了一种快速、安全和方便的抗SARS药物筛选方法。

SA14-14-2乙型脑炎病毒Vero细胞疫苗候选株的筛选及其表型和基因型特征

目的研制以Vero细胞为生产基质的SA14-14-2乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗候选毒株。方法将SA14-14-2株原始病毒在Vero细胞上传代并进行空斑克隆,对克隆株病毒进行Vero细胞培养,使用3周龄小鼠及3日龄乳鼠对脑内致病力进行测定,并进行乳鼠脑内回传、弱毒稳定性实验及免疫力实验等。结果挑选到10个病毒克隆株,通过全面对比后,筛选到1株病毒滴度高(>6.0 lgPFU/ml)且稳定的毒株SA14-14-2 VC_(6)。将该株与SA14-14-2原始株进行主要指标对比,结果表明,VC_(6)株全基因序列与原株相比仅有1个位点发生突变(S66L),对小鼠和乳鼠脑内致病力、弱毒稳定性、免疫原性均与原株相同。结论筛选到的SA14-14-2 VC_(6)株符合中国药典乙脑减毒活疫苗生产毒种的要求。各项主要指标不劣于SA14-14-2生产用毒种,是可应用Vero细胞培养生产的乙脑疫苗候选株。

SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,并进行验证,以期更好地控制产品安全性。方法 通过磁珠法对SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液进行DNA提取,采用探针型PCR对宿主细胞DNA残留量进行定量分析。对建立的方法进行线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性、准确度验证,并使用该方法对5批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)进行宿主细胞DNA残留量检测。结果 DNA标准曲线在300~0.003 pg/μL范围内线性良好(R~2均≥0.99);重复性和中间精密度验证相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<20%;定量限为0.001 pg/μL;样品稀释液与纯化液稀释液对检测无干扰;样品于53、55、57℃条件下孵育60 min及55℃条件下孵育56、60、64 min的检测结果无明显差异;准确度验证回收率在79%~83%,RSD <5%。用该方法检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)原液中DNA残留量适应性良好。结论 成功建立了SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法,该方法线性范围、重复性、中间精密度、定量限、专属性、耐用性和准确度均符合可接受标准,适用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)中宿主细胞DNA残留量的检测及质量控制。

SARS-CoV-24种奥密克戎变异株在Vero细胞中培养条件的优化

目的优化严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)4种奥密克戎(Omicron)变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.5疫苗候选株在Vero细胞中的培养条件。方法以细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、病毒核酸拷贝数及病毒滴度作为评价指标,分别对4种Omicron变异株在Vero细胞中培养的收获时间(24、48、72、96 h)及MOI(0.01、0.001、0.0001、0.00001)进行优化。结果4种Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.5在Vero细胞中培养的最佳收获时间均为72 h,最适MOI分别为0.001~0.00001、0.001~0.00001、0.01~0.00001及0.01~0.00001。结论优化了4种Omicron变异株在Vero细胞中的培养条件,为以Vero细胞为基质的SARS-CoV-2 Omicron变异株灭活疫苗的研发奠定了基础。

香菊胶囊溶液在Vero细胞中对单纯疱疹病毒2型的抑制作用

目的研究香菊胶囊溶液对单纯疱疹病毒2型的抗病毒作用,为生殖器疱疹的治疗寻找新的治疗手段。方法以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率和病毒抑制率来评价香菊胶囊溶液体外对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用。结果香菊胶囊溶液对Vero细胞的半数毒性浓度(TC_(50))为12.5mg/m L,药物和HSV-2共同作用2h后、病毒感染2h后加入药物、预防给药途径三种条件下对HSV-2的半数有效浓度(IC_(50))分别为1.901mg/m L,1.871mg/m L和1.942mg/m L,治疗指数(TI)分别为6.58,6.68和6.44,其抗病毒效果与阿昔洛韦差异无统计学意义(P>0.05)。结论香菊胶囊溶液在体外对HSV-2直接灭活作用明显,且对HSV-2的吸附和穿入细胞均有抑制作用,具有很好的体外抗疱疹病毒作用。

AI-2对鸭疫里氏杆菌粘附入侵Vero细胞及其相关基因转录水平的影响

【目的】自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2)作为细菌间的通用自诱导信号分子,参与细菌众多生理功能的调控。本研究通过开展AI-2在鸭疫里氏杆菌(Riemerella antatipestifer,RA)CH3株对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的粘附、入侵以及对RA相关基因调控作用的研究,为进一步研究AI-2对RA的调控作用奠定基础。【方法】在CH3(血清型1型)对Vero细胞的粘附、入侵过程中加入不同浓度的AI-2,研究其对CH3粘附、入侵Vero的影响;在添加184.0μmol/L AI-2的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中培养RA CH3菌株,利用real-time PCR来检测AI-2对RA相关基因转录水平的影响。【结果】结果表明,AI-2浓度为18.4μmol/L时,AI-2对CH3粘附Vero细胞的抑制性最强,为62%,当AI-2浓度为184.0μmol/L时,AI-2对CH3入侵Vero细胞的促进性最强为194%。荧光定量PCR结果表明AI-2对部分基因的转录有促进作用,对部分基因的转录有抑制作用。【结论】AI-2参与调控RA粘附、入侵Vero细胞及RA毒力因子、免疫原性蛋白基因以及代谢相关基因转录水平的调控。