棉花黄萎病真菌Verticillium dahliae木聚糖酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

【目的】从棉花黄萎病真菌Verticillium dahliae中克隆木聚糖酶基因,并在毕赤酵母中进行异源表达,研究酶学性质。【方法】通过多序列比对设计简并引物,扩增出真菌V.dahliae木聚糖酶基因片段,再采用基因组步行PCR技术获得全长木聚糖酶基因序列。经BLAST比对并结合GT-AG原则分析,该基因含有一个大小为63bp的内含子,利用DpnI介导的缺失方法对含内含子的全长木聚糖酶基因进行剪接,获得该基因的全长cDNA。将克隆到的cDNA在毕赤酵母GS115进行了表达,重组酶经纯化后进行酶学性质分析。【结果】BLAST比对显示,该cDNA推测的氨基酸序列和已知木聚糖酶的最高一致性为72%。测得该酶最适反应温度为45℃,最适反应pH值为6,在pH5-9维持50%以上的活性,对山毛榉材木聚糖具有最好的水解效果。Mg2+和Ca2+对酶有激活作用,分别提高了33.7%和16.6%,EDTA,β-巯基乙醇和NaN3对酶的活性基本没有影响,Tween-80和DMSO使酶活性提高了28.4%和12.8%。【结论】本文从引起棉花黄萎病的真菌V.dahliae中克隆到的木聚糖酶基因是在GenBank上登录的第一个来自棉花黄萎病真菌的木聚糖酶基因序列。本文所用的克隆方法可以高效的从植物病原真菌和白腐真菌克隆只含一个内含子的11家族的新木聚糖酶基因,避免了摸索原始菌株酶表达诱导条件,检测酶的活性等繁琐的操作。酶学性质分析显示该酶在低聚木糖的制备,面包改良上有潜在的应用价值。

大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的特异扩增

根据棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）核糖体基因ＩＴＳ区段的碱基编码序列，设计合成了１对为２６ ｂｐ 的 ＰＣＲ 特异扩增引物（引物１： ５′ＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＴＡＣＣＡＡＣＧ， 和引物２：３′ＣＧＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＧＣＡＡ），进行了大丽轮枝病菌 ＰＣＲ 特异扩增试验。试验结果表明：本试验设计合成的这对引物，能对大丽轮枝菌全基因组 ＤＮＡ 和人工接种棉花黄萎病病株组织特异地扩增到大丽轮枝菌核糖体基因ＩＴＳ区段的３２４ ｂｐ 分子片段，该对引物可用于棉花黄萎病的分子鉴定和分子监测。本试验结果对棉花黄萎病的早期诊断和病原菌的检测和监测有潜在的应用价值。