一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙鲆分离到一株病原菌M 4 ,革兰氏阴性 ,杆状 ,有极生和侧生鞭毛 ,能运动 ,菌落半透明。进行了常规生理生化和BIOLOG GN细菌鉴定系统测试 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的表型特征非常相似。为了进一步确定M 4的分类学地位 ,测定了其 16SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株M 4与V .carchariae的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株M 4可鉴定为Vibirocarchariae。

养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B1 7,人工感染实验证实其具有致病性。用Biolog GN细菌鉴定系统对B1 7进行测试 ,发现其与参考菌株的相似性较低 ,不能进行鉴定。常规生理生化测试表明 ,B1 7具有弧菌属的特征 ,其表型特征与Vibriosplendidus非常相似。为了进一步明确菌株B1 7的分类学地位 ,测定了其 1 6SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株B1 7与V .splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株B1 7可鉴定为V .splendidus。

几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价

目的:建立一种应用多重PCR技术,能够同时快速准确检测大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌4种常见肠道致病菌的方法。方法:根据大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌的特异基因作为目的基因,设计相应的引物,并进行实验优化以确立对4种肠道致病菌的检测体系。并对市售经果汁样品人工随机染菌后进行模拟样品验证。结果:该多重PCR方法能够有效地扩增出相应致病菌的目的基因片段,其中单核细胞增生李斯特菌扩增片段为155 bp,大肠杆菌O157扩增片段为366 bp,变形杆菌扩增片段为522 bp,副溶血弧菌扩增片段为199 bp,且特异性较强。对4种目标菌的检测灵敏度可达到103CFU.mL-1。能够检测出模拟样品中随机接种的任意3种细菌。结论:利用建立的多重PCR可以快速、准确地筛查大肠杆菌O157、副溶血弧菌、普通变形杆菌和单核细胞增生李斯特菌。

2005年福建省霍乱弧菌流行菌型特征分析

目的:了解福建省霍乱弧菌流行菌型特征,为控制传染来源提供科学依据。方法:采用血清学分型法、噬菌体-生物分型法及PFGE(脉冲场凝胶电泳)分型法对2005年霍乱疫情中不同来源的142株霍乱弧菌进行分型分析。结果:142株霍乱弧菌血清学、噬菌体-生物分型结果:流行株124株中O1群埃尔托稻叶1d型占95.16%(118/124株);其余菌株为6型以上非流行株。70株霍乱弧菌PFGE分型结果呈现3大类8种带型。结论:2005年霍乱疫情期间患者菌株与福州市闽江水系分离株菌型一致,表明具有高度同源性,而与市场水产品不相关。流行菌型更换而出现的埃尔托稻叶1d型,提示福建省今后仍有发生霍乱流行的可能。

近江牡蛎HSP70基因对溶藻弧菌感染的反应

采用实时荧光定量RT-PCR方法,检测了注射溶藻弧菌(Vibiro alginolyticus)后近江牡蛎鳃,闭壳肌,消化腺,外套膜,心脏以及血细胞中HSP70基因的表达变化。结果显示近江牡蛎这五种器官组织中的HSP70基因表达量均出现显著性高表达,且在鳃、外套膜和血细胞中的HSP70基因表达变化规律表现为典型的时间依赖性。血细胞中,显著高表达的峰值出现在24h,至72h恢复到对照水平,高表达持续时间最长:鳃中表达峰值出现时间较早,在第3h,随后在第12h便恢复到对照水平;外套膜,消化腺以及心脏中的峰值分别出现在6h,6h和3h,而在闭壳肌组织中,没出现显著性高表达。由此可见,近江牡蛎HSP70s可能在机体抗菌免疫过程中起了重要作用。

霍乱弧菌N16961超级整合子重复序列及基因盒分析

目的:确定O1群El Tor型霍乱弧菌N16961超级整合子(SI)中霍乱弧菌重复序列(VCR)的序列特点,以及VCR和基因盒的数量及位置。方法:用局部序列比对软件BLAST将VCR参考序列与霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体进行比对,用Artemis Comparison Tool查看比对结果获得比对区域的位置信息,并采用perl语言脚本获得霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体VCR相应区域的序列;用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VCR序列进行多序列比对,采用perl语言脚本处理比对结果获得一致性序列;用MEGA4.0软件查看多序列比对结果,并采用perl语言脚本计算各位置变异频率,据此分析霍乱弧菌N16961的Ⅱ号染色体上VCR和基因盒的特点。结果:在N16961的超级整合子中有158个VCR,其核苷酸长度为117～124 bp;其一致性序列有126个核苷酸,其中37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点;139个VCR与相邻的VCR之间至少有1个基因,19个VCR相互之间没有任何基因;N16961的SI中共存在146个基因盒,基因盒大小为390～5924 bp不等,每个基因盒中整合的基因数目为1～9个不等。结论:建立了SI中VCR和基因盒的分析流程,分析了SI中VCR的保守及变异位点,明确了霍乱弧菌N16961的SI中VCR和基因盒的信息,为霍乱弧菌和其他细菌中SI的研究提供了分析基础。

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe^(3+)、Cu^(2+)、Sn^(2+)和Zn^(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu^(2+)、Ba^(2+)、Na^+、Zn^(2+)、Ag^+、Sr^(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。

浙江沿海地区海及水产品霍乱弧菌污染状况调查分析

目的了解浙江省沿海地区的海及水产品霍乱弧菌污染状况和菌型特征,为制定海及水产品卫生管理措施和霍乱防治对策提供科学依据。方法选择3个沿海县市,分别在农贸市场、养殖场(或捕捞点)、餐馆等场所采集990份海及水产品标本,标本经碱性蛋白胨水增菌,4号培养基选择性培养,生化鉴定和血清、噬菌体分型,毒力基因检测。结果海及水产品带菌率为1.41%,其中甲鱼带菌率最高为8.9%。有稻叶型、小川型、0139群等3个血清型,各型菌株数分别为2株、2株、10株。12株菌株中9株有毒力基因,其中5株有3个毒力基因,1株只有 CTX、ACE 毒力基因,3株只有 ZOT 毒力基因。结论浙江省沿海地区海及水产品受到霍乱弧菌污染,霍乱弧菌3种菌型全有,大多具有毒力基因,能引起霍乱暴发的危险。

海港口岸输入性创伤弧菌分离鉴定与分子分型研究

目的对海港口岸输入性创伤弧菌DXV1108进行鉴定和分子分型研究。方法从一艘越南入境船舶的压舱水中分离获得1株病原菌,采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统进行分类鉴定和抗生素耐药性分析,并采用多位点序列分析(MLST)方法进行分子分型。结果该菌株99%的概率为创伤弧菌,对抗革兰氏阴性菌的抗生素敏感,MLST分析显示为一新发现的序列型。结论本研究对海港口岸防控输入性致病弧菌引发的传染病有重要意义。

一株新MLST型创伤弧菌的分离鉴定

目的对从住院病人脓液标本中分离的创伤弧菌(2012-DY VV1)进行病原学分析与研究。方法采用全自动微生物分析仪进行生化鉴定和耐药性分析;采用PCR方法检测溶细胞素vvhA基因,及vcg和16S rRNA基因分型;应用多位点序列分析(MLST)进行分子生物学分型。结果该菌株经生化鉴定为创伤弧菌(概率为90%);对大多数常用抗生素都敏感,但对头孢唑啉、头孢替坦中度敏感;PCR检测vvhA阳性,为vcgC-16S rRNA B基因型;菌株的序列型为glp6,gyrB 6,mdh 2,metG 12,purM 7,dtdS 15,lysA 12,pntA 7,pyrC 9,tnaA 15。结论该菌株的vcg和16S rRNA PCR分型为CB型,提示具有较强的致病能力;MLST分型为新发现的ST菌株,被命名为ST136,注册号为id-218。

2012—2014年无锡市不同来源副溶血性弧菌的病原学特征分析

目的了解近年来无锡市不同来源的副溶血性弧菌的毒力基因携带情况、血清型和耐药性。方法对于分别来源于食源性疾病事件、哨点医院监测标本、外环境监测样品的92株副溶血性弧菌分离株,采用PCR进行毒力基因鉴定,玻片凝集试验进行血清分群,纸片法进行耐药试验。结果 92株副溶血性弧菌中,食源性疾病事件、哨点医院、外环境监测这三种来源的分离株中携带tdh基因的菌株分别占85.7%(12/14)、88.6%(39/44)和14.7%(5/34);食源性疾病事件分离株和哨点医院分离株血清群以O3为主,分别占比85.7%(12/14)和65.9%(29/44),外环境监测分离株无优势血清群;食源性疾病事件、哨点医院、外环境监测这三种来源的分离株中耐氨苄西林的菌株分别占35.7%(5/14)、65.9%(29/44)和11.8%(4/34)。不同来源的菌株对氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、亚胺硫霉素都表现为100.0%敏感。结论 2012—2014年无锡市从食源性疾病事件、哨点医院监测标本和外环境监测样品分离出的副溶血性弧菌在毒力基因、血清群、耐药情况上均有较大差异。建议结合耐药试验结果,在无锡市临床治疗副溶血性弧菌感染病例时,抗生素使用首选氯霉素、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、亚胺硫霉素。

噬菌体裂解细菌过程中冷光实时监测活菌方法的建立

产毒素的霍乱弧菌Vibrio cholerae可导致严重腹泻,已引起7次全球大流行。对于烈性噬菌体清除霍乱弧菌的效果评价上,一般使用传统的活细胞培养计数及噬菌斑进行观察分析,但操作费时耗力,尤其不能实时获得菌株被裂解及残存细胞的数量变化。进一步探索简便、能够实时监测噬菌体裂解霍乱弧菌的方法是非常必要的。利用荧光报告质粒的策略、将可在霍乱弧菌中高表达生物冷光的质粒转化至O1血清群霍乱弧菌耐药菌株中,通过测定比较生物冷光以及活菌计数,实时分析了噬菌体对液体培养状态下霍乱弧菌的裂解效果,结果显示:冷光值作为监测指标与传统的活细胞计数方法有很高的相关性,通过测定霍乱弧菌耐药株的冷光值监测霍乱弧菌活细胞的数量,可实时分析噬菌体裂解霍乱弧菌过程中细菌残存数量。这种分析方法与菌落计数和噬斑形成观察相比,能够重复对同一样本进行无干扰的连续多时间点检测,没有经过再培养或噬斑形成的时间迟滞,有利于进行噬菌体与宿主菌相互作用的实时监测分析。