霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列的测定与分析

测定和分析霍乱弧菌分型噬菌体VP3基因组序列,并为ElTor型霍乱弧菌两类菌株的分型方法原理提供研究基础。鸟枪法构建VP3噬菌体全基因组随机文库;测序拼接成最小重叠群,引物步移法填补缝隙序列,拼接后获得VP3全基因组序列。PCR随机扩增噬菌体DNA片段并酶切鉴定;预测可能存在的开放读码框(ORF);对VP3和相关噬菌体的DNA聚合酶基因作进化树分析,协助判定VP3的分类;对预测的部分启动子区利用报道基因进行活性分析。VP3全基因组为环状双链DNA,长度39504bp;酶切鉴定结果与序列一致。确定了49个ORF,注释了27个ORF的编码产物,其中有20个基因产物与T7样噬菌体同源,包括RNA聚合酶(RNAP)、参与DNA复制的蛋白、衣壳蛋白、尾管及尾丝蛋白、DNA包装蛋白等。DNA聚合酶(DNAP)进化树分析表明VP3与T7样噬菌体有同源性。将预测的10个启动子序列克隆到lacZ融合质粒pRS1274上,经检测均具有启动子活性。测定和分析VP3的基因组序列,基因组结构与进化树分析提示VP3属于T7噬菌体家族。

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs间的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNApol)基因的进化树分析。结果:VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G+C含量为50.56%,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G+C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNApol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp 1和芽孢杆菌噬菌体GA 1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。

霍乱弧菌分型噬菌体VP2部分生物学特性及基因组分析

目的对霍乱弧菌分型噬菌体VP2基因组、蛋白质组和增殖特征等开展分析,获取VP2的生物学特征。方法电镜观察噬菌体VP2的形态,测定最佳感染复数和一步生长曲线;通过在线RAST(https://rast.nmpdr.org/)对噬菌体VP2基因组进行编码基因预测及功能注释;提取VP2成熟颗粒中的蛋白质进行质谱分析;使用pyani进行噬菌体全基因组平均核苷酸一致性(ANI)聚类分析。结果噬菌体VP2为典型的20面体短尾噬菌体,最佳感染复数为1∶100,一步生长曲线结果显示其潜伏期大约为60 min,60~120 min为暴发期,120 min后为稳定期。预测存在49个开放阅读框(ORF),VP2成熟颗粒蛋白质谱分析显示有34个蛋白与预测的基因相对应,ANI结果显示,VP2与弧菌噬菌体CJY的ANI最高。结论明确了分型噬菌体VP2的基本生物学和基因组特征,获得成熟颗粒中包含的蛋白成分,为后续研究同源噬菌体及其与霍乱弧菌的相互作用提供了基础。

pre-CTX_(φ)噬菌体在霍乱弧菌基因组中的遗传多样性研究

溶原性噬菌体CTX_(φ)携带的ctxAB基因是霍乱弧菌产毒株最主要的毒力基因,而pre-CTX_(φ)作为CTX_(φ)的前体,缺失ctxAB基因编码序列。基因组中整合了pre-CTX_(φ)噬菌体的霍乱弧菌非产毒株,可通过其携带的zot和ace基因,引起患者轻度至中度的霍乱样腹泻症状,存在公共卫生风险。本研究收集了公开发表的1649株霍乱弧菌草图序列和43株完成图序列,使用比较基因组学和群体遗传学方法,对上述霍乱弧菌数据集进行综合分析,结果表明:不同谱系霍乱弧菌基因组中pre-CTX_(φ)的拷贝数存在差异;其中L3b.4菌株中pre-CTX_(φ)拷贝数呈现随分离年份增加的趋势。L2、L4、L7和L3b谱系存在pre-CTX_(φ)与CTX_(φ)共整合的现象,并发现pre-CTX_(φ)位于pre-CTX_(φ)/CTX_(φ)噬菌体家族系统发育树的祖先位置。这些发现进一步丰富了对霍乱弧菌基因组中pre-CTX_(φ)/CTX_(φ)噬菌体家族遗传多样性的认识,为阐明其整合机制和进化规律提供了必要基础,并为携带此类噬菌体霍乱弧菌的检测及防控提供借鉴。