霍乱弧菌JS94484株CTX^(EVC)_φ和nct-CTX^(new)_φ基因组变异区序列分析

目的对霍乱弧菌JS94484株CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组变异区进行序列分析。方法采用聚合酶链反应、基因测序及序列分析。结果JS94484株CTXEVCφ基因组的ig1、rstR、ig2和ctxAB基因与EVC标准株N16961的高度同源。JS94484株nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因,与目前发现的3种类型的同源性均较低,趋异性均较高。CTXEVCφ和nct-CTXnewφ基因组zot基因末端约60bp的基因序列差别较大,推测的氨基酸序列差别也较大。JS94484株的tcpA基因序列与EVC标准株N16961的完全一致。结论霍乱弧菌nct-CTXnewφ基因组的ig1、rstR和ig2基因为新类型,基因功能有待于进一步研究。

杭州市首例外环境水体中检出稻叶型霍乱弧菌及病原学分析

目的监测杭州市外环境水体中霍乱弧菌并对分离菌株进行病原学分析。方法2006年5月-2006年9月采集杭州市运河水系水样75份,按国标方法进行霍乱弧菌分离与鉴定。采用PCR检测霍乱弧菌分离菌株ctxA和tcpA毒力基因携带情况。采用KB纸片法检测霍乱弧菌分离菌株对14种临床常用抗生素的敏感性。结果从75份运河水标本中检出O1群霍乱弧菌稻叶血清型1(编号06-19)。O1群霍乱弧菌06-19株噬菌体分型6K,属于霍乱弧菌非流行株;ctxA和tcpA毒力基因PCR结果均为阴性。该菌株对11种抗生素均显示不同程度敏感性,但对四环素、氯霉素、链霉素耐药。结论本次分离的O1群霍乱弧菌06-19株属于不产生霍乱肠毒素和菌毛的非流行菌株。由于霍乱弧菌非流行株可引起散发性腹泻以及运河水系与杭州市市民日常生活的密切关系,故仍有必要加强对运河水系霍乱弧菌监测及污染源管理。

以报告基因分析霍乱弧菌噬菌体VP1的预测启动子

VP1为感染并裂解霍乱弧菌的噬菌体,全基因组为环状双链DNA。通过测定该基因组序列,预测出15个可能的启动子区,利用报告基因质粒转化及全噬菌体共感染的策略分析了这些推测启动子在霍乱弧菌中的活性,将预测的启动子区分别克隆到启动子探测lacZ融合质粒载体pRS1274,在转化于大肠埃希氏菌受体菌株JM109中时,所有克隆子均呈现兰斑。同时将质粒电击到缺失了lacZ基因的霍乱弧菌菌株7743△Z,然后用噬菌体VP1感染转化菌株。在转化成功的13个含预测启动子片段的重组质粒中,通过检测β_半乳糖苷酶活性表达随感染后时间的变化,提示P17为早期启动子,P2、P3、P9等为中期启动子,P18为晚期启动子。

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。

霍乱弧菌O139群新类型ig1-rstR-ig2结构和功能研究

目的研究霍乱弧菌(VC)O139群新类型ig1-rstR-ig2结构及功能。方法分别扩增CTXφ或nct-CTXφ基因组串联体的第一个基因组核心区末端和第二个基因组RS区起始端之间的基因,PCR产物测序及序列分析。扩增rstA的操纵区,克隆入pRS591质粒lacZ基因前,转化入JM109菌株,检测β-半乳糖苷酶活性,以反映rstA启动子强度。将不同类型rstR及启动子区分别克隆人pACYC184质粒,再将重组pACYC184质粒转化入携带不同重组pRS591质粒的JM109菌株中,检测β-半乳糖苷酶活性,以反映rstR表达产物RstR对rstA表达的影响。结果calc、ET和newO139类型ig1-rstR-ig2序列同源性分别为85.1%～91.6%、9.4%～17.7%和8.0%～26.2%。不同类型rstA的启动子强度不同,calc和ET类型的较高,newO139类型的较低。RstR对同类型rstA启动子活性表达均有明显的抑制作用,而对不同类型的则无明显抑制作用。结论阐明了霍乱弧菌(VC)O139群calc、ET和newO139类型ig1-rstR-ig2结构及功能。

杭州市下城区餐饮业健康人群中检出3株小川型霍乱弧菌

目的:对食品从业人员粪便标本进行霍乱弧菌监测,对分离到的霍乱弧菌进行病原学鉴定,为霍乱防治提供信息。方法:按照W S289-2008《霍乱诊断标准》和《霍乱防治手册》第五版,分离霍乱弧菌,并确定所分离的霍乱弧菌血清型和生化反应特性;采用噬菌体生物分型区别流行和非流行株及不同菌型;采用PCR检测霍乱弧菌分离菌株ctxA和tc-pA毒力基因携带情况;采用脉冲场凝胶电泳(Pu lsed field gelelectrophoresis,PFGE)进行分子分型;采用K-B纸片法检测分离株对14种抗生素的敏感性。结果:从辖区同一家餐饮店不同工种的食品从业人员肛拭子中检出3株O1群霍乱弧菌小川血清型。3株菌噬菌体生物分型均为15 e,属埃尔托生物型非流行菌株,霍乱弧菌毒力基因PCR检测结果为ctxA阴性,tcpA阳性,3株菌PFGE分型结果一致。结论:检出的3株O1群霍乱弧菌埃尔托生物型虽然为非流行菌株,但从同一家餐饮店在同一时间段同时检出,杭州市尚属首例,应引起密切关注。传统的细菌系统鉴定结合分子分型方法,为霍乱弧菌的快速检测和流行病学溯源提供了技术支持。

霍乱弧菌ct-B基因替代溶原性噬菌体非必需区的研究

首先利用转座因子诱变的方法，分离一些不释放噬菌体的突变子，然后通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方法证明转座因子插入的位置在Ｏ１３９群霍乱弧菌９３Ｘ１１噬菌体基因组中部的ＨｉｎｄⅢ大片段上。由此推测９３Ｘ１１噬菌体基因组非必需区位于两侧。采用低熔点胶回收与染色体相邻的ＨｉｎｄⅢＢ片段，利用体外重组方法使外源基因替代Ｂ片段上的０．７８６ｋｂＥｃｏＲⅠ小片段，通过同源重组将这种改变的Ｂ片段重组到正常的９３Ｘ１１噬菌体基因组Ｂ片段位置上。结果表明，这种外源基因并不影响该噬菌体的溶原性和免疫性。由此认为，这一替代区域属９３Ｘ１１噬菌体基因组上非必需区。然后对它进行核酸序列测定。通过基因重组的方法霍乱弧菌保护性抗原基因ｃｔ－Ｂ取代了溶原性噬菌体基因组上的非必需区。利用ＧＭ１－ＥＬＩＳＡ方法检测ｃｔ－Ｂ的表达，结果表明，ｃｔ－Ｂ表达良好，并且分泌至胞外。重组菌苗免疫家兔后的血清稀释度在１∶４０时，能抵抗１０６ＣＦＵ／ｍｌ毒株的攻击。因此，该重组菌苗可能成为霍乱弧菌很好的菌苗候选株。