河流弧菌-Ⅱ(Vibrio fluvialis-Ⅱ)噬菌体-VP_8的分离与研究

1996年夏季，从皱纹盘鲍脓疱病发病区采集海水样品46份，以皱纹盘鲍脓疱病病原菌河流弧菌-Ⅱ（Vibriofluvialis-Ⅱ）为指示菌，从这些样品中分离纯化到多株噬菌体，并对其中VP8进行了电子显微镜观察及生物学特性研究。其头部20面体的直径约57nm；尾鞘宽为18nm,长的33nm；尾轴宽约7nm，长约58nm；从形态上看属于BradlcyA型。

哈维弧菌对皱纹盘鲍不同组织内细菌群落结构的影响

利用Illumina测序技术研究了皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)消化道、鳃和足部的菌群结构,以及受哈维弧菌(Vibrio harveyi)胁迫后皱纹盘鲍消化道、鳃和足部肌肉菌群的动态变化。在皱纹盘鲍的消化道、鳃以及足部肌肉中检测到9个门的细菌,其中变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,在3种组织中的占比分别为30.1%~64.4%、37.45%~70.6%和71.1%~85.9%;拟杆菌门(Bacteroidetes,5.53%~46.09%)、梭杆菌门(Fusobacteria,4.43%~36.80%)及软壁菌门(Tenericutes,0.60%~28.77%)为次优势菌门;其余为放线菌门等5个菌门和一些未知类群。在属水平上,皱纹盘鲍消化道内的优势菌属为支原体属(Mycoplasma,15.85%~34.55%);鳃组织中的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas,54.81%);足部肌肉中的优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas,44.83%~69.76%)和Curvibacter(21.24%),此外还有Pelomonas等菌属。引入病原哈维弧菌后,随着胁迫时间的延长,皱纹盘鲍消化道内弧菌的数量由7.2×10^(5)cfu·mL^(–1)升高至10.9×10^(5)cfu·mL^(–1);血液内的弧菌数量由2×10^(3)cfu·mL^(–1)升高至4.7×10^(3)cfu·mL^(–1);在受哈维弧菌胁迫48h后足部肌肉中弧菌的数量下降,其余时间点足部肌肉中弧菌的数量均增加。除了受哈维弧菌胁迫24h后消化道的Ace、Chao指数以及受胁迫96h后消化道的Ace指数高于对照组之外,其余时间点鲍消化道、鳃及足部肌肉的Ace、Chao指数均低于对照组。除受哈维弧菌胁迫24h后的鲍消化道、足部肌肉试验组和胁迫96h后的鳃组织试验组中的Shannon指数高于对照组外,其余时间点均低于对照组。引入哈维弧菌后,消化道内拟杆菌门及梭杆菌门的丰度均增加;鳃组织的变形菌门丰度下降,梭杆菌门的丰度增加;足部肌肉的变形菌门丰度增加,拟杆菌门的丰度则下降。在属的水平上,除了个别时间点外,消化道内的假单胞菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、中度产丙酸菌属(Propionigenium)的丰度均增加,支原体属丰度则下降;鳃组织中的拟杆菌属、Kordia、中度产丙酸菌属的丰度均增加;足部肌肉中假单胞菌属的丰度也增加。本研究从微生态角度探究常见的病原哈维弧菌对宿主体内菌群组成结构的影响,为进一步研究宿主对病原哈维弧菌的响应机制及弧菌病的防治提供了新思路。

皱纹盘鲍脓疱病病原菌──河流弧菌-Ⅱ的抗药机制的初步研究

1993年9月至1995年末，大连地区的一龄鲍至成鲍都出现了脓疱病，用常规方法从3个养殖厂的病鲍中分离到了3个菌株，分别为D株、N株和T株。经鉴定这3个菌株为同一种──河流弧菌-Ⅱ。这3个菌株来自3个不同的海区、不同的单位，并且这3个单位使用的抗生素种类和浓度也木同，所以这3个菌株对18种抗生素的敏感度也木同。D株对环丙沙星（抑菌坏直径30mm）、复方新诺明（抑菌坏直径27mm）等敏感，而对青霉素、青霉素Ⅱ、氨苄青霉素（抑菌环直径0mm）等耐药。N株除对青霉素Ⅱ、白霉素、吡哌酸等耐药外，对其它12种抗生素都敏感或中度敏感（抑菌环直径13．5－30mm）。T株对氟派酸（抑菌环直径22mm）、环丙沙星（抑菌环直径20．3mm）等敏感，而对氯霉素、复方新诺明等耐药。研究发现，经常使用同一种抗生素很容易使病原菌产生耐药性．连续3d使用单一的抗生素（青霉素）就会产生耐药的菌株。为证明上述3个菌株的抗药性是属于哪一类，以T株为例，提取总DNA，并对总DNA进行EcoRⅠ酶切图谱分析，图谱有明显的异同，说明3个菌株的抗药性不同可能与基因突变有关。不管是非遗传型还是遗传型，都是由于抗生素为细菌提供了耐药突变株的选择环境，从而使耐药菌株得以大量繁殖。

皱纹盘鲍脓疱病菌—河流弧菌Ⅱ胞外产物的研究

利用杯碟法研究了河流弧菌Ⅱ的胞外产物．结果表明：河流弧菌Ⅱ含有淀粉酶、明胶酶、脂肪酶、酪蛋白酶、溶血因子，不含卵磷脂酶、脲酶．由于淀粉酶有分解糖原的作用；明胶酶、酪蛋白酶分解胶原等蛋白成分；脂肪酶分解了脂类；溶血因子使鲍的血细胞溶解，在病灶中，核仁消失，双层核膜破裂，核质外泄．病灶内的核糖体减少或消失，线粒体异形，嵴减少或甚至消失使其呈双层膜的空泡状结构，肌糖原消失，内质网变成大小不一的圆形空泡．在晚期的病灶内，肌纤维、结缔组织细胞几乎已完全溶解，只有许多血淋巴细胞存在．除少量细胞结构完整外，大部分血淋巴细胞的质膜破裂，胞质内充满圆形液泡，大部分胞质变性后破碎消失．核质均质化，呈无结构状态，核仁消失，核内具有数个高电子密度的结晶状颗粒．

大连近海河流弧菌Ⅱ噬菌体的分离与研究

1996年、 1 997年两个夏季 (5～ 8月 )、从大连市水产养殖公司所属的不同的皱纹盘鲍养殖区采集海水及海底淤积物样品共 76个。以河流弧菌Ⅱ (Vibriofluvialis)为指示菌 ,从这些样品中分离到 1 9株噬菌体。对它们进行了电子显微镜的观察 ,结果发现它们均属于BradleyA型。进一步的血清型分析表明 ,这 1 9株噬菌体分别属于 4个血清型 ,并对这 4个血清型的代表株VP1 ,VP2 ,VP4及VP8进行了寄主范围、一次生长曲线测定及其他生物学特性的初步分析。

皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究

于1993-1995年，用免疫法防治皱纹盘鲍脓疱病。河流弧菌-Ⅱ分离自大连水产养殖公司、太平洋海珍品养殖公司的患脓疱病的皱纹盘鲍;健康皱纹盘鲍，由大连水产养殖公司石庙苗种厂提供。鲍血淋巴细胞的体外吞噬实验:取健康皱纹盘鲍的血淋巴与肝素和菌液按一定比例混合后，置湿盒内37℃培养30min，取一滴涂片，吕氏液染色后观察。用该病原菌制做菌苗，大量扩增病原菌，用0.1％-1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24-120h，用生理盐水反复清洗，除掉甲醛;再用生理盐水稀释到所需浓度。通过反复传代降低毒性，制成活菌苗。用两种菌苗在稚鲍、一龄鲍（2-3cm）和成鲍（6-8cm）上实验。结果表明，鲍的血淋巴细胞约有三种，三种细胞都有吞噬细菌的能力，有的细胞象变形虫样变形，在细胞膜上吸附着很多细菌，有的细菌已被吞到细胞内;该病原菌可同鲍的血清发生凝集反应;菌苗的效果明显，可提高成活率约50％以上。由上述结果可见，皱纹盘鲍的血淋巴细胞具有吞噬细菌的能力，在菌苗的作用下，血淋巴细胞增殖并活跃地吞噬异源致病菌，同时鲍血液中的免疫因子也被激活，参与免疫的过程，使皱纹盘鲍成活率明显提高。

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),bb4为哈氏弧菌(V.harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果:20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107cfu/mL的bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明,bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。

鲍养殖环境中弧菌密度变化及其与环境因子的关系

采用培养法对皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）养殖水体中的弧菌（Vibrio）密度进行了测定,监测了主要环境因子（水温、溶解氧、p H、盐度、氧化还原电位、亚硝酸盐、硝酸盐、氨盐、磷酸盐）,并探讨了弧菌密度与环境因子的关系。结果表明,养殖水中弧菌密度全年变化范围为0.2×102~6.0×103cfu·m L-1,平均为1.7×103cfu·m L-1。水温≤25℃时弧菌密度与各环境因子均无相关性。水温〉25℃时弧菌密度与水温显著相关（P〈0.05）,与氧化还原电位、硝酸盐、氨盐极显著相关（P〈0.01）,与其他环境因子相关性不明显。

皱纹盘鲍脓毒败血症病原菌的发现及初步研究

１９９２年９月至１９９４年１１月间，在大连沿海发现的致皱纹盘鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓｄｉｓｃｕｓｈａｎｎａｉ）脓毒败血症的一株病原菌，对皱纹盘鲍人工感染有很高的死亡率，并且与自然发病有相同的症状。其特征为：革兰氏染色阴性，短杆状，极生单鞭毛，无芽孢，氧化酶和过氧化氢酶均为阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，０／１２９１０μｇ敏感，０％和８％ＮａＣｌ胨水中不能生长，不利用葡萄糖酸盐和蔗糖等，定名为坎氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ）。

三角褐指藻和小球藻藻粉添加对皱纹盘鲍稚鲍生长的影响

【目的】研究微藻添加对皱纹盘鲍稚鲍生长的影响,探索三角褐指藻和小球藻作为稚鲍饲料添加剂的可行性。【方法】在饲料中添加1%、3%和5%的三角褐指藻和小球藻藻粉,比较各处理稚鲍的生长参数,全组织总抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)、α-淀粉酶(AMS)、纤维素酶(CL)活性以及内脏囊中细菌、弧菌的数量。【结果】饲料中添加三角褐指藻和小球藻藻粉可显著提高稚鲍壳长,显著降低稚鲍死亡率,其中以5%三角褐指藻处理稚鲍的壳长最大(16.38±2.49 mm),1%小球藻处理稚鲍的死亡率最低(2.00%±0.67%)。饲料中添加三角褐指藻可显著提高稚鲍体质量、增重率,显著降低饵料系数。养殖40 d后,5%三角褐指藻处理和5%小球藻处理的SOD活性(12.9±0.75、12.99±0.42 U/mg)均显著高于对照。3%、5%三角褐指藻处理的T-AOC活性(1.15±0.03、1.19±0.06 U/mg)显著高于对照。5%三角褐指藻处理的AMS活性(4.92±0.74 U/dL)显著高于对照,各处理间的CL活性差异不显著。养殖40 d后,5%三角褐指藻和5%小球藻处理稚鲍内脏囊中细菌和弧菌的数量均显著低于对照。【结论】饲料中添加三角褐指藻对皱纹盘鲍稚鲍生长的促进效果优于小球藻,以添加5%三角褐指藻的效果最优。

皱纹盘鲍基质金属蛋白酶基因的克隆与表达分析

为了探索基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)在软体动物中的存在形式及其在机体抗菌免疫中的作用,以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象,采用分子生物学技术克隆得到皱纹盘鲍MMP-16、MMP-17和MMP-213个基因部分序列,并对其进行生物信息学分析和多序列比对。此外,利用荧光定量PCR技术检测了Hdh-MMPs在皱纹盘鲍不同组织及副溶血弧菌感染前后各组织中的表达情况。结果显示,克隆得到的Hdh-MMPs序列包含完整的催化结构域和(或)类血红素结合区,Hdh-MMPs蛋白与多种软体动物的MMPs具有序列相似性。荧光定量PCR结果显示,Hdh-MMP-16和Hdh-MMP-17在血淋巴细胞中表达量最高,而Hdh-MMP-21在鳃中表达量最高。副溶血弧菌感染后,Hdh-MMP-16的表达量在鳃中呈现上升趋势,而Hdh-MMP-17的相对表达量呈现先上升后下降的趋势,Hdh-MMP-21基因在鳃和肝胰腺中呈现一定程度的上调表达。本研究结果表明,Hdh-MMP-16/17/21可能与皱纹盘鲍抵御病原菌入侵的先天免疫性调控相关。