哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果

参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列，设计引物扩增OmpW的开放阅读框，序列分析结果显示该基因全长645bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a（＋），在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白，融合蛋白分子量约为43．8ku，且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37oC，IPTG浓度0．1mmol／L，诱导时间5h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体，ELISA方法检测抗体效价达1：30000，Western．Blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应，提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果，构建了真核表达重组质粒pcDNA-OmpW，然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示，免疫接种后第7—28天，在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织中均存在质粒分布；RT．PCR结果显示，免疫接种后第7～28天，红笛鲷上述组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明，红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western．Blot分析表明，DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白，并诱导产生了相应抗体。攻毒实验结果表明，免疫保护率高达60％，可见pcDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈维氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。