Isolation and Phylogenetic Analysis of Vibrio ichthyoenteri Strains from Hapalogenys nitens

[ Objective] This study aimed to isolate and identify Vibrio ichthyoenteri strains from diseased Hapalogenys nitens. [ Method] In January 2013, dis- eased H. nitens juveniles from a maricultural farm in Luoyuanwan Bay of Fuzhou City were selected to investigate the incidence, clinical symptoms and pathogenic characteristics. Liver, spleen, kidney and gill of five diseased H. nitens juveniles were collected for bacterial isolation and pure culture to conduct morphological, physiological and biochemical assays, 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis. The susceptibility of five strains to 30 kinds of antimicrobial drugs was detected. [ Result] The death of H. nitens juveniles was caused by bacterial infections. The isolated strains fzlyw201301071 and fzlyw201301072 belonged to the same genus as Vibrio ichthyoenteri. Drug susceptibihty test suggested that there were no significant differences in drug sensitivity and resistance among different strains. [ Conclusion] This study provided theoretical basis for the prevention and control of diseases in aquaculture animals.

养殖大菱鲆中牙鲆肠弧菌的分离鉴定及组织病理学

2007年1月,山东省胶南某养殖场人工养殖的大菱鲆发生严重病害并大批死亡。病鱼的主要症状是体表溃疡,腹腔积液,肠道肿胀,肝脏萎缩,胆囊暗绿色等。从病鱼胆囊中分离纯化得到优势菌株,命名为da3。人工感染试验证实,该菌株对大菱鲆有较强的致病性。对体重为25 g的大菱鲆的半数致死量为每尾鱼2×106CFU。通过细菌16S rDNA序列测定及形态学和生理生化特征研究确定,该病原菌为牙鲆肠弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。组织病理学观察表明,病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道和脑的微观结构发生了明显的病理变化,由此引起的器官功能衰竭可能是病鱼死亡的主要原因。

红鳍东方鲀病原鱼肠道弧菌的生物学特性研究

对引起红鳍东方鲀发病死亡的病原细菌进行了分离和主要生物学特性研究,包括病原性、形态特征、理化特性、16S rRNA基因序列及其系统发育学分析、胞外酶及溶血素活性、K抗原及耐药性等。结果表明,引起红鳍东方鲀发病死亡的病原细菌为弧菌属(VibrioPacini 1854)的鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri Ishimaru,et al.1996),2株代表菌株16S rRNA基因序列(GenBank登录号分别为:EF611424和EF635304)与GenBank数据库中鱼肠道弧菌的同源性在98%—100%,且在构建的MP系统发生树中与鱼肠道弧菌聚为一个分支。分离菌不具有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、DNA酶、脲酶、明胶酶和卵磷脂酶活性,且在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上不溶血。不具有K抗原。人工感染试验中分离菌对红鳍东方鲀表现出明显的致病性。药敏试验结果显示,4株分离菌对供试37种抗菌药物中的苯唑青霉素和杆菌肽2种耐药。

鱼肠道弧菌外膜蛋白抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠法和苯甲基磺酰氟法提取鱼肠道弧菌外膜蛋白。SDS-PAGE图谱显示,PMSF提取的鱼肠道弧菌有19条带,Sarkosyl法提取的鱼肠道弧菌有14条带,其中111、105、87、78、61、58、53、48、45、40、36、33、32、31 kD蛋白带为2种方法共同条带,101、55、42、27、25 kD为PMSF法特有条带。此外,以制备的兔抗鱼肠道弧菌全菌血清为第一抗体,应用Western-blotting技术分析了鱼肠道弧菌外膜蛋白的抗原性,结果显示分子量为106、87、61、58、55、42、36、32 kD的8条蛋白带发生了免疫反应。

鱼肠道弧菌间接ELISA快速检测法的建立

为准确、快速诊断鱼肠道弧菌感染所致的海水鱼类全身性败血症,以鱼肠道弧菌为抗原,制备抗鱼肠道弧菌多克隆抗体,建立了鱼肠道弧菌间接酶联免疫吸附检测方法。该方法最佳反应条件为:抗原包被密度为107 cfu/mL,免疫血清稀释度为1∶211。病原菌检测灵敏度为每孔105 cfu/mL。抗血清与迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、恶臭假单胞菌、鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻胶弧菌、秦皇岛弧菌8种水产致病菌的交叉反应结果呈阴性。用该法检测人工感染后的牙鲆和健康牙鲆,在发病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、腹水等处检测出病原菌而健康鱼则为阴性。该技术能够准确、快速检测出鱼肠道弧菌。

两种致病性弧菌外膜蛋白抗原特性的分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)两种方法提取两种海洋致病性弧菌——鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri和秦皇岛弧菌Vibrio qinhuangdaorasp.nov.的外膜蛋白,并应用SDS-PAGE分析了其外膜蛋白的构成。电泳图谱显示,相对分子质量为44 000、36 000、34 000、26 000、23 000的蛋白条带为两种弧菌外膜蛋白中的共有条带。采用Western-Blotting法比较了两种弧菌外膜蛋白抗原性的异同,结果表明,鱼肠道弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、43 000、34 000、32 000、28 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应;秦皇岛弧菌外膜蛋白中相对分子质量分别为46 000、26 000的结构蛋白可同时与两种弧菌抗血清发生反应。两种弧菌中均存在相对分子质量为46 000、26 000的外膜蛋白,且具有共同的抗原性。

鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术的研究

以抗鱼肠道弧菌单克隆抗体为基础,结合流式细胞术,根据荧光信号强弱比例确定检测鱼肠道弧菌时所需单克隆抗体的最优反应量为200μL,最佳反应时间为45min。在最优反应条件下,抗鱼肠道弧菌单克隆抗体可特异性识别鱼肠道弧菌,阳性荧光信号比例达12.9%;对不同密度的鱼肠道弧菌进行重复性试验,变异系数均在5%以内,说明流式细胞术具有较好的精密度;人工感染健康牙鲆试验表明,流式细胞术检测法能快速从发病鱼的鳃、肝、脾、肾、腹水等部位检测出病原菌,而对照组为阴性;本试验建立的鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术为鱼肠道弧菌的快速检测提供了新方法。

鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

以鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri为抗原免疫小鼠,用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,分别采用酶联免疫吸附(ELISA)技术和间接免疫荧光抗体(EFAT)技术筛选强阳性杂交瘤细胞株,亚克隆阳性细胞株,获得5株抗鱼肠道弧菌单克隆抗体(1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)。Western blotting分析结果显示,单抗2D10与相对分子质量为44 200、36 700的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;用流式细胞术(FCM)检测单抗强度,结果显示阳性荧光比例为13.63%,阴性对照荧光比例不足1%;人工感染牙鲆试验结果表明,运用该单抗能够建立鱼肠道弧菌的快速诊断方法。

鱼肠道弧菌免疫检测方法的研究

采用灭活的鱼肠道弧菌作为抗原,制备兔抗血清,建立了鱼肠道弧菌的间接荧光抗体检测技术(indirect im-munofluorescence assay test,IFAT)、Western-blotting免疫印迹检测技术。IFAT结果显示阳性信号覆盖整个菌体,明亮,清晰,荧光信号呈长弧形且两端钝圆,与鱼肠道弧菌形状一致。Western-blotting结果显示共10条蛋白带发生免疫反应,其中6条蛋白带结果较清晰,显示出较强的特异性免疫反应,阴性对照组无条带。IFAT和Western-blotting结果说明所建立检测方法能够准确、快速的检测出鱼肠道弧菌。

鱼肠道弧菌疫苗制备及免疫保护效果

通过比较不同灭活剂及灭活条件对鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)的灭活效果,确定以0.4%(v/v)福尔马林溶液在25℃下处理30h作为疫苗的最佳灭活条件,用灭活的鱼肠道弧菌疫苗免疫大菱鲆并测定了该疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibri parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarium)等的免疫保护力,结果表明,采用注射免疫方式接种后,针对鱼肠道弧菌的免疫保护率达75%;溶藻弧菌免疫保护率为67.6%;鳗弧菌免疫保护率为50%;副溶血弧菌免疫保护率为57.2%;采用浸浴免疫方式接种后,疫苗针对鱼肠道弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的免疫保护力分别为25%、22.3%、11.1%、12.5%。

利用鱼抗血清及鼠抗血清分析鱼肠道弧菌全菌蛋白抗原性

从患腹水症牙鲆脾脏组织中分离得到一株优势菌株CD86,经人工感染实验证实菌株CD86对牙鲆有较高的致病力,其半致死浓度为1.8×105 CFU/尾。通过生理生化特征测定和16SrDNA基因序列分析,判定菌株CD86为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。以福尔马林灭活的菌株CD86全菌分别免疫健康的小鼠和牙鲆,ELISA测定鼠抗血清和牙鲆抗血清效价分别为12 800和1 200。利用间接免疫荧光技术检测2种抗血清与菌株CD86的结合活性,结果显示,2种血清均可同菌体发生阳性反应,其中鼠抗血清阳性反应信号明显强于鱼抗血清。同时,利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性,结果显示分子量为27、30和37kDa的菌体蛋白条带与2种血清均发生阳性反应;分子量为19、25、28、29和35kDa的菌体蛋白条带仅与鼠抗血清发生阳性反应;分子量为45kDa的菌体蛋白条带只与鱼抗血清发生阳性反应。研究结果表明,牙鲆对菌体抗原产生的抗体应答与小鼠存在明显差异,该发现对研筛鱼用高效的鱼肠道弧菌亚单位疫苗具有重要的参考价值。