Villin1启动子调控miR-7-Sponge真核表达载体的构建及其对小鼠炎症性肠炎模型的影响

目的构建绒毛蛋白(Villin1)启动子调控的miR-7海绵体序列(简称miR-7 Sponge)的真核表达载体,观察其对小鼠炎症性肠病(IBD)模型病理损伤的影响。方法荧光原位杂交(FISH)检测葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium salt,DSS)作用后小鼠结肠组织中miR-7的水平及定位情况;抽提小鼠结肠组织基因组DNA,PCR扩增Villin1启动子序列,纯化该产物并经Kpn I/Mlu I双酶切,克隆入pGL3-Basic载体,构建pGL3-Basic-Villin1启动子真核表达载体(p-V);随后将p-V和miR-7-Sponge(化学合成)分别经Mlu I/Xho I双酶切、连接,构建pGL3-Villin1-miR-7-Sponge真核表达载体(命名为p-V-miR-7sp),通过酶切和测序鉴定载体。通过2%DSS喂养野生型(WT)小鼠7 d,3 d水恢复,建立IBD小鼠模型,分别在建模的第2,4,6天通过尾部静脉注射p-V和p-V-miR-7sp载体进行治疗;Real-time PCR检测心、肝、肾、淋巴结及结肠组织中miR-7的表达,观察小鼠结肠形态和长度的变化,H&E染色分析小鼠结肠组织病理结构及炎症损伤变化。结果(1)酶切和测序结果显示成功构建p-V-miR-7sp真核表达载体;(2)Villin1启动子调控的miR-7-Sponge真核表达载体可特异降低结肠组织中miR-7的表达水平(P<0.05);(3)与对照组比,p-V-miR-7sp治疗组IBD模型小鼠结肠长度明显增加;H&E染色显示结肠组织中淋巴细胞浸润明显减少,隐窝结构轻微破坏,其损伤明显减轻。结论Villin1启动子调控的miR-7-Sponge真核表达载体不仅特异降低结肠组织中miR-7水平且明显减轻IBD模型小鼠的病理损伤。

甲泼尼龙对大鼠呼吸机相关肺损伤时p38MAPK信号通路的影响

目的探讨甲泼尼龙预先静脉注射对大鼠呼吸机相关肺损伤（VILI）的影响。方法将60只SD大鼠随机分为三组：对照组（C组）、机械通气（H组）和甲泼尼龙组（P组）。C组不行机械通气，自然呼吸空气；H组：大潮气量机械通气4h，吸入氧浓度为2l％；P组：机械通气前10rain静脉注射甲泼尼龙20mr,／kg。4h后放血处死大鼠，检测支气管灌洗液（BALF）中总蛋白、TNF—d、巨噬细胞炎性蛋白-2（MIP-2）的浓度，测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性，测定肺干湿质量比（W／D）；Westernblot法检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（P-p38MAPK）、抗丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）的表达；观察各组肺组织病理变化和细胞凋亡情况。结果与C组比较，H组P-p38MAPK蛋白灰度值显著升高（F=4．26，P〈0．05），同时伴有BALF中总蛋白、TNF-α和MIP-2的浓度、MPO活性、肺组织细胞凋亡指数、W／D比均显著升高（均P〈0．05）；与H组比较，P组P-p38MAPK蛋白灰度值明显下降，MKP-1蛋白灰度值上升（F=4．26、3．95，均P〈0．05），同时伴有肺组织中BALF中总蛋白、TNF-α和MIP-2的浓度、MPO活性、肺组织细胞凋亡指数、W／D比均显著降低（均P〈0．05）。H组肺组织病理损伤较重。结论甲泼尼龙可抑制VILI发生、发展，其机制与增加MKP-1表达，抑制p38MAPK磷酸化，进而减轻肺组织炎症、水肿和细胞凋亡有关。

SDF-1/CXCR4在滋养层细胞中的表达及其在母胎免疫耐受中的作用

目的:研究趋化因子SDF1及其配体CXCR4在滋养层细胞中的表达及其在母胎免疫耐受中的作用。方法:取早孕期的绒毛,分离纯化培养绒毛外滋层养细胞(extravilloustrophoblast,EVT),用免疫细胞化学染色法检测SDF1与CXCR4在绒毛中的表达。用流式细胞术筛选源于滋养层细胞高表达CXCR4的绒癌细胞株用于体外微孔隔离室迁移实验,以分析SDF1的趋化活性。用免疫组织化学染色法检测早孕期绒毛及足月妊娠胎盘中SDF1及CXCR4的表达。结果:在EVT中可检出SDF1和CXCR4的表达,在一定范围内,SDF1的趋化活性与其浓度呈正相关(r=0.68,P<0.01)。10μg/L的SDF1趋化作用最强,最大趋化指数CI为1.62±0.12。在早孕期的绒毛及足月胎盘中,滋养层细胞的胞膜和细胞质中均检出SDF1和CXCR4的表达,但在足月胎盘中的表达强度明显低于早孕期的绒毛组织(P<0.01)。结论:SDF1/CXCR4在妊娠中发挥着重要作用,对维系母胎免疫耐受具有重要意义。

绒毛蛋白1在单侧肾切除Habu肾炎小鼠模型中的作用

目的探讨单侧肾切除(UNX)小鼠Habu肾炎模型与正常小鼠Habu肾炎模型在肾脏功能、肾脏病理表现及肾小球蛋白绒毛蛋白1(VIL 1)表达等方面的异同及其分子机制.方法将24只6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(18~20 g)随机分为2组,实验组(n=12)接受UNX后通过尾静脉注射竹叶青蛇毒(HSV)构建Habu肾炎模型(HSV-U NX组),对照组(n=12)接受假手术后行蛇毒尾静脉注射构建Habu肾炎模型(HSV组);通过血液生化检测2组小鼠肾功能水平,并采用过碘酸-雪夫染色观察2组小鼠肾组织病理改变;进一步通过蛋白质组学对二者肾小球蛋白表达量进行分析,筛选出2组间的表达差异蛋白,于体外小鼠系膜细胞中研究差异蛋白对细胞增殖及凋亡的作用及机制.结果HSV-UNX组小鼠的血肌酐和尿素氮水平较HSV组显著升高(均P<0.01),其肾组织系膜溶解水平高于HSV组(P<0.0001),系膜增殖水平低于HSV组(P<0.001);蛋白组学分析及Western blotting证实VIL1在HSV-UNX组小鼠的表达量低于HSV组;在小鼠系膜细胞中,敲低VIL1表达可通过上调caspase 3、Bax、p21及p27蛋白表达,促进细胞细胞凋亡(P<0.01),抑制细胞增殖(P<0.05).结论VIL1在单肾切除Habu肾炎小鼠模型中表达下调,VIL1下调可通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡导致肾小球自我修复能力下降,加重肾功能损害.

血浆抗凝血酶Ⅲ、绒毛蛋白1和凝集素含量在维吾尔族妇女宫颈病变进程中的动态变化及意义

目的 根据前期工作中运用血浆蛋白质组学研究筛选出的一系列血浆候选差异蛋白指标,探索血浆中ATⅢ、VIL1和CLU表达含量在维吾尔族妇女宫颈病变进程中动态变化。方法 收集82例新疆地区维吾尔族宫颈病变血浆样本(宫颈炎22例,CINⅡ~Ⅲ20例,宫颈癌早期20例,宫颈癌晚期20例),用酶联免疫法检测血浆中ATⅢ、VIL1和CLU的表达含量,分析其与宫颈病变进程的关系及相关性。结果 ATⅢ的表达含量随着宫颈病变进程逐渐下降,CLU和VIL1的表达含量随着宫颈病变的进程逐渐升高(P【0.05)。以宫颈炎组作为对照组,ATⅢ、VIL1和CLU的表达含量与CINⅡ~Ⅲ组、宫颈癌早期组比较差异均有统计学意义(P【0.05)。ATⅢ、VIL1和CLU表达含量之间的动态变化关联性分析差异无统计学意义。结论 维吾尔族妇女宫颈癌发生发展与ATⅢ、VIL1和CLU的表达含量动态变化密切相关,可成为宫颈癌早期诊断的血浆候选预警蛋白标志物。

鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其与免疫功能的相关性分析

目的研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及病毒白介素-10(VIL-10)蛋白质的表达,明确VIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响。方法在鼻咽癌组织和鼻咽炎症组织中,分别应用RT-PCR及Western Blot检测BCRF-1mRNA和蛋白产物VIL-10的表达;流式细胞术检测两组患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。结果①BCRF-1mR-NA在34/40例(85%)鼻咽癌组织和16/20例(80%)鼻咽炎症组织中表达阳性,两者差异无统计学意义(P>0.05)。②30/40例(75%)鼻咽癌组织VIL-10呈阳性,10/20例(50%)鼻咽炎症组织VIL-10呈阳性,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。③40例鼻咽癌患者分为VIL-10阳性组和VIL-10阴性组,VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(24.99%±3.88%vs.35.92%±6.31%,0.86 vs.1.99,均P<0.05),而VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD8+T细胞明显高于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(30.61%±3.34%vs.20.10%±7.68%,P<0.05)。结论鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物VIL-10;VIL-10使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制作用。

Wnt/β-catenin通路激动剂-LiCl对3T3-L1细胞Villin 2表达的影响

试验旨在探究Wnt/β-catenin通路激动剂-Li Cl对3T3-L1细胞Villin 2表达的影响,明确Villin 2在脂肪生成中是否与Wnt/β-catenin信号通路相关。培养3T3-L1细胞,分别设置对照组和20 m M Li Cl处理组,油红O染色观察3T3-L1细胞分化的形态变化;荧光定量(PCR)检测Villin 2 mRNA水平的变化。结果表明:20 m M Li Cl处理组相对于对照组显著抑制3T3-L1细胞分化;在3T3-L1细胞分化过程中和完全分化后20 m M Li Cl处理组的Villin 2 mRNA相对表达量都显著高于对照组(P<0.05)。因此,20 m M Li Cl能在3T3-L1细胞中成功激活Wnt/β-catenin信号通路,Villin 2在3T3-L1细胞分化过程中和完全分化后都是作为一个下调基因起抑制脂肪生成的作用,并且Villin 2与Wnt/β-catenin信号通路相关。

四川一次超级单体风暴的多普勒雷达观测分析

利用常规天气资料和多普勒天气雷达等资料对2015年7月27日发生在四川资阳的一次伴随冰雹大风的超级单体进行综合分析。结果表明:(1)该超级单体具有较大的CAPE值,适宜的0℃层和-20℃层高度,有利于雹粒的增长,为大暴雨和冰雹提供了不稳定能量。(2)此次风暴具有超级单体风暴的典型特征,在雷达反射率因子上,中低层有"钩状回波"、弱回波区、三体散射长钉,中高层有回波悬垂现象,速度图上是气旋式流场,后发展为中气旋,中气旋首先出现在中低层,随后向上向下发展。(3)垂直累计液态水含量(VIL)在发生冰雹前会有一个跃增变化,在30分钟内从5kg/m2跃增到75kg/m2,VIL跃增变化提前冰雹发生,对冰雹具有警示作用。(4)三体散射长钉是预示冰雹的一个重要特征,此次风暴的三体散射出现在高度5~10km,只在2个体扫时间内出现过。

GC法测定3-氨基-1-金刚烷醇的有关物质

目的:建立GC法测定3-氨基-1-金刚烷醇(VILS-03)中有关物质金刚烷胺、1,3-金刚烷二醇、1,3,5-金刚烷三醇、1,3,5,7-金刚烷四醇的含量。方法:采用DB-1毛细管柱(50 m×0.53 mm×5μm),进样口温度300℃,柱流速2.0 mL·min^(-1),进样方式用分流进样,分流比5∶1,载气为氮气,进样量为1μL;外标法计算。结果:空白溶剂均不干扰VILS-03有关物质的检测;金刚烷胺、1,3-金刚烷二醇、1,3,5-金刚烷三醇、1,3,5,7-金刚烷四醇均在一定范围内线性良好,r均>0.990;定量限分别为1.375、1.557、1.363、4.042μg·mL^(-1);50%、100%、150%水平的加样回收率均良好。金刚烷胺平均加样回收率(n=3)分别为107.3%、107.3%、105.2%,RSD分别为0.67%、1.1%、2.3%。1,3-金刚烷二醇平均加样回收率(n=3)分别为93.6%、100.3%、95.6%,RSD分别为4.7%、1.6%、2.6%。1,3,5-金刚烷三醇平均加样回收率(n=3)分别为94.6%、96.7%、95.7%,RSD分别为1.9%、1.0%、2.4%。1,3,5,7-金刚烷四醇平均加样回收率(n=3)分别为95.1%、97.4%、99.5%,RSD分别为1.2%、0.63%、2.1%。室温条件下,对照品溶液和加标样品溶液在70.5、63 h内稳定性良好。3批次样品中,1,3-金刚烷二醇检出量分别为0.46%、0.36%、0.59%,其余杂质均未检出。结论:该方法灵敏度高,专属性和准确度好,可用于VILS-03有关物质的检测。