GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。

Vinexin-β基因敲除在小鼠心肌梗死后心脏重构中的作用

目的采用野生型(WT)小鼠和Vinexin-β基因敲除(KO)小鼠建立心肌梗死(MI)模型,研究Vinexin-β在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制。方法分别以WT和KO小鼠为实验对象,采取结扎左冠状动脉前降支的方法建立小鼠MI模型(WT-MI组,n=34;KO-MI组,n=27);只在前降支处穿过一支短丝线不做结扎的假手术组(WT-Sham组,n=12;KO-Sham组,n=15)。术后7 d采用HE染色评价MI面积,超声心动图检测心功能,生物信号采集处理系统监测血液动力学指标。原位末端标记(TUNEL)染色法检测MI周边区心肌细胞凋亡,Western blot法检测MI周边区抗凋亡基因Bcl-2、caspase-3和促凋亡基因Bax、caspase-3 cleavage的蛋白表达水平及核转录因子(NF)-κB通路中IκBα和p65蛋白磷酸化(p-IκBα,p-p65)及其总蛋白(T-IκBα,T-p65)水平;免疫荧光实验检测MI周边区的T淋巴细胞(CD3^+)、中性粒细胞(LY6G+)及巨噬细胞(MAC1+)等炎症细胞浸润程度。从小鼠存活率、心功能、病理分析及分子生物学等途径来评价Vinexin-β在MI后心脏重构中的作用。结果与WT-MI组相比,KO-MI组可提高小鼠的存活率(81.48%vs 50.00%,P<0.05),减小MI面积[(7.62±1.08)%vs(15.48±1.24)%,P<0.05]和改善心功能。TUNEL染色显示,KO-MI组梗死周边区的凋亡细胞较WT-MI组减少[(0.75±0.12)%vs(1.07±0.48)%,P<0.05]。Western blot法显示,KO-MI组梗死周边区抗凋亡基因Bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平较WT-MI组升高(P均<0.05);促凋亡基因Bax和caspase-3 cleavage蛋白表达水平较WT-MI组降低(P均<0.05);KO-MI组的p-IκBα、T-p65和p-p65蛋白表达水平较WT-MI组显著降低,T-IκBα水平显著升高(P均<0.05),提示IκBα和p65的磷酸化水平受到抑制。免疫荧光染色显示,KO-MI组梗死周边区的T淋巴细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等炎症细胞数量较WT-MI组减少(P均<0.05)。结论 Vinexin-β基因缺失可减轻小鼠MI周边区的炎症和凋亡反应,从而减小MI面积和改善心功能,因此可提高小鼠MI后的存活率。