Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用,对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用,筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明:Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC 50在0.24~0.72μg/g之间,其中Cry1Ab的毒力最强,显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC 50均大于50μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时,增效作用最强,增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。

基于转录组学的Vip3Aa杀美洲大蠊的作用机制研究

美洲大蠊Periplaneta americana是常见的家居害虫,前期研究发现营养期杀虫蛋白3Aa(Vegetative insecticidal proteins 3Aa,Vip3Aa)蛋白具备杀美洲大蠊作用,但其机制尚不明确。本研究对美洲大蠊饲喂Vip3Aa蛋白后,进行中肠转录组分析,所得raw data过滤获得44.60 Gb Clean Data。通过生物信息学分析,共注释了23470条基因,发掘新基因5757个。与对照组比较,共获得2302个差异表达基因,其中1539个上调、763个下调。KEGG分析表明,差异基因主要涉及调控溶酶体、其他多糖降解、淀粉和蔗糖代谢、糖胺聚糖降解、昆虫激素合成、鞘糖脂生物合成、药物代谢和凋亡等信号通路,其中溶酶体相关差异表达基因50个,凋亡相关差异表达基因21个。透射电镜和Hoechst 33342染色显示,Vip3Aa给药后,中肠上皮细胞出现凋亡典型的形态改变,线粒体肿胀、空泡、破裂,出现大量次级溶酶体,可见部分细胞的细胞核凝集、固缩、荧光强度增加。结果表明Vip3Aa蛋白可能通过上皮细胞溶酶体-线粒体损伤介导凋亡通路的激活,发挥杀美洲大蠊作用。

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从 114个Bt菌株和 4 1个Bt标准菌株中筛选到 39株即约 2 5 %的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析 ,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生 89kD大小的蛋白 ,其中有 4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选 2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株 ,即S10 1和 6 11,并分别进行vip3A基因的克隆和测序 ,再与GenBank上所登录的其它 6个全长vip3A基因和 2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较 ,结果表明 ,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的 2个vip3A基因即vip3A S10 1和vip3A 6 11分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP S10 1和pOTP 6 11,转化到大肠杆菌M15 ,经 1mmol LIPTG诱导后均表达 89kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明 ,Vip3A S10 1和Vip3A 6 11分别有 4 8%和 35 %的蛋白是可溶的。将Vip3A S10 1和Vip3A 6 11蛋白和已报道的Vip3A S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodopteralitura)幼虫进行生物测定 ,结果表明 ,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异 ,这说明了Vip3A个别氨基酸的?

棉铃虫幼虫取食Vip3Aa蛋白后的中肠组织病理变化

为了进一步明确Vip3Aa的作用机制,利用透射电镜观察了棉铃虫4龄幼虫取食含Vip3Aa蛋白饲料后中肠杯状细胞的病理变化,并比较了其病变与取食含Cry1Ac饲料后棉铃虫组织病变的差异。取食含Vip3Aa饲料后,棉铃虫幼虫的中肠杯状细胞逐渐发生病变,主要表现为:微绒毛肿胀、脱落;细胞核核膜界限不清晰,染色质分布不均匀;线粒体变形、数量减少,内脊不清晰;内质网杂乱不规则、数量减少。与取食Cry1Ac的棉铃虫相比,取食Vip3Aa的棉铃虫中肠杯状细胞发生病变较为缓慢,在取食12h后才发现明显病变,随着取食时间的增加病变越来越明显;而取食Cry1Ac的棉铃虫2h后中肠杯状细胞就出现明显病变。本研究可为Vip3Aa作为新毒素策略的重要蛋白在棉铃虫Helicoverpa armigera综合防治中更好地发挥作用提供理论依据。

苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的检测与杀虫活性测定

为获取高活性的野生Bt菌株,对从土壤中分离的99株Bt菌株进行了营养期杀虫蛋白的分子鉴定和生物活性测定。根据已知的vip3 A基因序列设计1对特异性引物,进行PCR鉴定,55株扩增得到1.2 kb的目的片段。对31株阳性菌株的营养期杀虫蛋白活性进行了初步测定,结果显示,Bt LS1和LS8菌株毒力最高,2菌株对2龄甜菜夜蛾的体重抑制率分别为91.14%和93.59%。选取Bt LS1和LS8菌株进行胞内外营养期蛋白杀虫活性测定,发现Bt LS1和LS8菌株对初孵甜菜夜蛾体重抑制率分别为45.1%和43.2%,对初孵棉铃虫的校正死亡率分别为(22.1±1.4)%和(55.3±3.7)%,对2龄棉铃虫的体重抑制率分别为(78.7±6.6)%和(50.4±2.4)%。

国产Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾的抗性测定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是世界性重大农业害虫。种植转基因Bt作物是主要的防治手段之一。我们利用室内生物测定方法评价了国产Bt-Cry1Ab玉米(转化体C0030.3.5)和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米(转化体DBN3601和DBN3608)对草地贪夜蛾1~4龄幼虫的毒力。结果显示,供试两种转基因玉米共6个品种皆可高效表达目标杀虫蛋白并对草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用,对1龄幼虫的致死率达到59%~100%,存活幼虫的生长发育亦受到显著抑制。表明国内研发的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果,其中Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米的防治效果显著优于Bt-Cry1Ab玉米,两种转基因玉米皆具有较好的商业化应用前景。

苏云金杆菌营养期蛋白杀虫活性及Vip3A-LS1基因克隆

对营养期高活性杀虫菌株进行筛选,得到高效菌株BtLS1,对其营养期杀虫蛋白活性及发酵特性进行了系统研究,克隆了该菌株的vip3A新基因。测定了31株vip3A基因阳性菌株营养期杀虫蛋白的活性,发现BtLS1和BtLS8菌株对甜菜夜蛾Spodopteraexigua生长的抑制作用明显高于其他菌株。进一步研究表明,BtLS1菌株营养期杀虫蛋白对初孵和2龄甜菜夜蛾幼虫的体重增长抑制率分别为95.3%±2.1%和90.7%±6.6%;对棉铃虫Helicoverpaarmigera初孵幼虫的校正死亡率为22.1%,对2龄幼虫的体重增长抑制率为78.7%±6.6%。发酵液中以胞内可溶性物质为主。设计vip3A全长基因特异引物PCR扩增,插入质粒pBluescriptSK(+),克隆测序证实该菌株中存在vip3A新基因,命名为Vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968。按该序列推断的蛋白与同类蛋白的8个氨基酸之间存在差异。

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125μg/mL,0.238μg/mL和9.238μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。

新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因,并将测序结果提交到GenBank(序列号:AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因,Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因,生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域,推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合;N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋,可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外,Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。

新型vip3Aa基因的克隆与杀虫活性的测定

为了给生物防治提供更多的基因资源,以从黑龙江省分离的100株苏云金芽胞杆菌进行PCRvip3类基因鉴定,对vip3类基因进行克隆表达及生物活性测定,为vip基因储备奠定基础。利用vip3类通用引物进行基因鉴定并进行全长基因克隆表达和生物活性测定。结果表明,菌株LB73经Blast对比后发现含有vip3Aa类基因,克隆基因全长序列为2370bp,编码789个氨基酸残基,分子量为88kD,并在国际基因库GenBank中登记,其登录号为JQ228436,由Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为vip3Aa46。构建原核表达系统,并进行杀虫活性的测定。vip3Aa46甜菜夜蛾LC504.02μg/g,棉铃虫LC50387.72μg/g。生测结果表明,vip3Aa46表达的可溶性蛋白对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力;对棉铃虫幼虫具有一定毒力。

苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。

利用荧光指示分子IeGFP比较vip3A和cry1Ia基因启动子活性

苏云金芽孢杆菌(Bt)的Vip3A和Cry1Ia蛋白质序列无同源性,但具有其他相似的特征,例如在孢子形成早期合成,然后跨膜转运至胞外。本研究以新型融合荧光蛋白IeGFP为报告分子,比较vip3A(Pv)和cry1Ia基因(Pi)启动子的调控模式和活性。结果表明,在大肠杆菌中,两者均为组成型启动子。通过荧光信号强度的比较发现,在大肠杆菌中,Pi活性显著强于乳糖操纵子调节基因启动子(PlacI,P<0.01),但比PlacI增强型突变体(PlacIq,P<0.01)和cry1Ac基因启动子(Pac,P<0.01)弱。在3个Bt启动子中,Pv活性最弱,接菌12 h后,与PlacI接近(P>0.05)。在Bt菌株中,Pv对IeGFP的表达调控与之前报道的Pi相似。启动子的Shine-Dalgarno(SD)序列与目的基因起始密码子(AUG)之间的间隔区域在调节细菌的蛋白质翻译效率方面发挥重要作用。本研究中构建的大部分Pv与Iegfp基因的间隔区域突变,均导致相应大肠杆菌和Bt细胞的荧光强度显著降低(P<0.05),说明融合荧光蛋白IeGFP具有较好的灵敏度。该研究不仅确定了2种启动子在Bt和大肠杆菌中的活性,而且验证了IeGFP指示弱启动子活性的可行性。

苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11和Vip3Aa39片段置换对其杀虫活性的影响

为了寻找苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白与杀虫活性相关的关键氨基酸片段,通过基因水平上的分子操作对其蛋白氨基酸片段分别进行置换,成功获得8个置换体蛋白:11N-39C、39N-11C、11N-11M-39C、39N-39M-11C、11N-39M-39C、39N-11M-11C、11N-39M-11C和39N-11M-39C.将vip3Aa11、vip3Aa39和置换体基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中诱导表达,得约88 ku的蛋白片段.对小菜蛾(Plutella xyllostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)分别进行室内生物活性测定,结果显示相较于Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白,除39N-11M-39C杀虫活性升高外,其他置换体蛋白对小菜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫的杀虫活性均呈现不同程度的降低,其中对棉铃虫的杀虫活性相对变化不明显.胰蛋白酶消化结果显示,Vip3Aa11和Vip3Aa39蛋白以及置换体蛋白11N-39C、39N-11C、11N-39M-11C、39N-11M-39C均可被消化成约62 ku的抗性核心多肽.上述置换体蛋白的构建为进一步研究Vips蛋白的杀虫机制提供了参考.

Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合特性

【目的】营养期杀虫蛋白Vip3A是一种由苏云金芽孢杆菌在对数生长期产生的新型杀虫毒素。Vip3A与敏感昆虫中肠上皮细胞的结合是其发挥杀虫活性的关键步骤。为进一步探究Vip3A毒素的杀虫机理,研究Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡(BBMVs)的结合特性。【方法】在大肠杆菌中用IPTG诱导表达Vip3Aa10,用亲和层析和离子交换层析的方法纯化蛋白,并用胰蛋白酶活化Vip3Aa10,得到Vip3Aa10-T。然后分析Vip3Aa10前毒素和Vip3Aa10-T对甜菜夜蛾的杀虫活性,用免疫印迹法和配体印迹法分析Vip3Aa10-T与甜菜夜蛾BBMVs的结合特性以及在甜菜夜蛾BBMVs上的结合蛋白。【结果】Vip3Aa10-T与Vip3Aa10前毒素对甜菜夜蛾的杀虫活性很高。Vip3Aa10-T在pH8.0时更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合,并且能够与非敏感性昆虫黄粉虫BBMVs结合。在相同pH条件下,Vip3Aa10前毒素比Vip3Aa10-T更容易与甜菜夜蛾BBMVs结合。Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMVs上有4条结合蛋白,其分子量分别为80、38、31和22kDa。【结论】活化的Vip3Aa10与甜菜夜蛾BBMVs的结合是pH依赖性的,并且能与BBMVs上的4个蛋白结合。

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。

转Vip3Aa基因的球孢白僵菌工程菌的构建及其对马尾松毛虫毒力的增效作用

根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa序列设计全基因扩增引物,并在引物两端添加合适的酶切位点进行PCR扩增,纯化的PCR产物和载体pbarGPE1分别经Xho I和EcoR I双酶切、连接,构建真菌表达载体pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经Sca I酶切线性化后,利用芽生孢子转化法转入昆虫病原真菌球孢白僵菌Bb13菌株内,得到白僵菌工程菌株Bb13V。RT-PCR结果证明Vip3Aa在工程菌株中已得到成功转录。在室内恒温25℃条件下,用喂食、喷雾以及两者相结合的方法,分别测定1×10^5、1×10^6、1×10^7、1×10^8和2×10^8孢子.mL^-1 5个不同孢子浓度下原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫的毒力。结果表明,在前4种不同浓度的处理条件下,采取3种不同的处理方式,工程菌株均比喷雾处理的原始菌株致死率提高30%以上;喷雾处理的毒力提高33.6-62.1倍;喂食处理的致死率均高于喷雾处理。在1×108孢子.mL^-1浓度下,喂食处理的致死率显著高于喷雾处理,致死中时缩短6.89 d。因此,Vip3Aa基因在转入白僵菌后得到了表达,从而赋予白僵菌可观的胃毒作用,使得工程菌对松毛虫的毒力明显增强。

杀虫蛋白Vip3Aa11对亚洲玉米螟及其寄生性天敌腰带长体茧蜂的影响

【目的】本文的研究目的是明确杀虫蛋白Vip3Aa11对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis及其寄生性天敌腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum的影响。【方法】首先利用生物测定的方法用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的人工饲料饲喂亚洲玉米螟初孵幼虫,7 d后观察记录亚洲玉米螟的死亡情况和体重。然后用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的人工饲料饲喂被腰带长体茧蜂寄生的亚洲玉米螟初孵幼虫,以含6μg/g印楝素的人工饲料作为阳性对照,10 d后记录亚洲玉米螟幼虫的死亡和被寄生情况,并在茧蜂化蛹结茧及羽化后分别记录茧重以及单个寄主的出蜂量,以此评价Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的间接影响。再者,用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的20%蜂蜜水饲喂腰带长体茧蜂成虫,以含100μg/g印楝素的20%蜂蜜水作为阳性对照,观察记录腰带长体茧蜂成蜂的死亡情况;不同处理的腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟10 d后记录亚洲玉米螟的死亡和被寄生情况,并在子代茧蜂化蛹结茧及羽化后记录茧重及单个寄主的出蜂量,以此评价Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的直接影响。【结果】生物测定结果显示,100μg/g的Vip3Aa11蛋白处理7 d后亚洲玉米螟幼虫的平均死亡率为50.7%,平均体重抑制率为77.1%。间接影响试验结果显示,被腰带长体茧蜂寄生后的亚洲玉米螟幼虫取食含有Vip3Aa11蛋白的人工饲料后死亡率明显升高,腰带长体茧蜂茧重和单头出蜂量大幅度下降,而寄生率及羽化后的成虫寿命没有受到不利影响。直接影响试验结果显示,腰带长体茧蜂取食含有100μg/g Vip3Aa11蛋白的蜂蜜水对腰带长体茧蜂成虫寿命和寄生率、亚洲玉米螟幼虫死亡率以及腰带长体茧蜂子代的茧重、单头出蜂量和成虫寿命均没有产生不利影响。【结论】本研究利用生测体系从直接和间接两方面评价了Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的影响,结果表明腰带长体茧蜂对高于Bt作物中表达的Vip3Aa11蛋白浓度不敏感,Vip3Aa11蛋白不会对腰带长体茧蜂产生直接的不利影响;造成的间接影响可能主要是由于寄主自身质量的下降而引起。

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白Vip3A研究

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,Vip)Vip3A是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白。Vip3A广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守。其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同。本文主要对Vip3A杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述。