布鲁氏菌VirB8-PCR方法的建立

目的建立VirB8-PCR方法,用于布鲁氏菌病的诊断和致病力因子的检测。方法以布鲁氏菌病致病力因子——四型分泌系统中的VirB8基因为模板,设计引物,建立VirB8-PCR方法,优化反应条件和程序,对布鲁氏菌标准株、疫苗株和当地分离株进行检测。结果13株布鲁氏菌标准株和6株疫苗株PCR检测结果均为阳性;沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌和链球菌均为阴性;检测11株当地分离株,9株也为阳性,2株为阴性。PCR检测特异性为100%,敏感性为153fgDNA(相当于30个菌)。结论VirB8-PCR方法特异、敏感,能用于布鲁氏菌病的监测和致病力因子的检测。

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法(iELISA)。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。

布鲁氏菌病VirB8-PCR诊断试剂盒的特异性评价

使用VirB8-PCR诊断试剂盒对布鲁氏菌标准株、疫苗株及新疆分离株共7株布鲁氏菌的VirB8基因序列扩增、克隆并与Genbank中发表的VirB8基因序列(AF226278)进行比较和分析,发现:该基因非常保守,7株布鲁氏菌的同源性在99.2%以上,其中A菌与Rev1基因序列100%同源,B菌与Genbank发表的基因序列100%同源;牛种(544A、A19)和羊种(M5、Rev1)分别各自在相同部位发生了相同的碱基突变,因此VirB8基因有可能做为布鲁氏菌疫苗菌的鉴定分类基因。VirB8基因在布鲁氏菌中高度保守,可作为布鲁氏菌检测模板,VirB8-PCR诊断试剂盒特异、敏感,检测结果可靠。

羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白B细胞抗原表位分析

应用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域;应用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析,Vir B8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域可能是优势B细胞抗原表位。

pEGFP-N1-VirB8真核表达载体的构建及其在大鼠脑内的表达

目的构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统VirB8蛋白的真核表达载体pEGFP-N1-VirB8,研究其在大鼠脑内的表达,为探讨VirB8蛋白的功能及在布鲁氏菌致脑损害中的作用奠定基础。方法利用从羊种布鲁氏菌中提取的总DNA为模板,从中扩增出羊布鲁氏菌VirB8全长序列,并克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-N1-VirB8真核重组载体。采用注射法将阳离子脂质体和重组质粒pEGFP-N1-VirB8混合后注入大鼠侧脑室,以空白质粒及生理盐水为对照组,转染1周后取脑组织制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(greenfluoerscentportein,GFP)的表达,并用Western blot检测融合蛋白的表达。结果经双酶切及测序鉴定证明pEGFP-N1-VirB8载体构建成功;荧光显微镜下观察可见转染pEGFP-N1-VirB8表达载体的大鼠脑组织有GFP的表达;Western blot结果显示,VirB8融合蛋白在大鼠脑组织中表达。结论 pEGFP-N1-VirB8载体构建成功,且阳离子脂质体介导的pEGFP-N1-VirB8重组质粒在大鼠脑内可成功表达VirB8融合蛋白。

牛布氏菌virB8基因的克隆及原核表达

目的克隆牛布氏菌virB8基因并在大肠杆菌中进行表达。方法从牛布氏菌S19基因组DNA中PCR扩增virB8基因片段,插入pEASY-E1载体中,构建重组表达质粒pEASY-virB8,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经HisTrapTMFF纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果扩增的virB8基因大小为720 bp;重组表达质粒pEASY-virB8经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,表达量占菌体总蛋白的17.3%;纯化的重组蛋白纯度为85%,Lowry法测定蛋白浓度为1.52 mg/ml,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功克隆了牛布氏菌virB8基因,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为新型疫苗的研发及布氏菌鉴别诊断方法的建立提供了有效的候选抗原。

广西家畜布鲁氏菌病的监测分析

目的对广西家畜布鲁氏菌病进行监测。方法采用虎红平板凝集和试管凝集试验对2009-2011年广西14个市的16 143份家畜血清进行布鲁氏菌抗体监测;同时对1 070份家畜脾、胎衣、流产胎儿等样本以及10份布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性家畜的子宫或睾丸进行布鲁氏菌分离和鉴定。结果 2009年有1头种公猪,2010年有1头牛和8头山羊被检出为布鲁氏菌抗体阳性;经生化特性和PCR鉴定有1株从布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性羊内脏分离到的细菌被鉴定为羊种布鲁氏菌。对分离的羊种布鲁氏菌毒力基因VirB8的克隆测序结果显示,VirB8基因在布鲁氏菌种型间高度保守。结论虽然广西家畜布鲁氏菌防治达到稳定控制标准,但需加强家畜引种和动物流通检疫工作,防止因引种和动物流通而将布鲁氏菌引入广西。

不同的病原菌检测方法比较评价可疑布鲁氏菌

目的:寻找布鲁氏菌病病原学检测工作的一种便利、快速、特异及敏感性较高的快速诊断方法。方法:收集247份病料,并经细菌学方法分离方法得到26株可疑家畜布鲁氏菌株,接着用分子生物学Vir B8-PCR和AMOS-PCR方法对这批可疑菌株进行确诊鉴定,并对不同对比试验方法结果及应用价值进行了评价。结果:细菌学分离方法与Vir B-PCR及AMOS-PCR方法结果一致。AMO S-PCR方法结果同时还显示26株可疑家畜布鲁氏菌株包括19株菌为羊种布鲁氏菌和7株菌为牛种布鲁氏菌。结论:细菌学分离方法所需时间较长、繁琐有感染风险,且不能确定被检可疑布鲁氏菌的属性;Vir B-PCR方法虽然快速、敏感、比较安全等,但是只能确定布鲁氏菌,而不能鉴别菌株属性;AMOS-PCR方法快捷、经济、安全、便利、特异,敏感,且能鉴别菌株属性。