4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛恶性卡他热病毒(MCFV)4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10^(1),1.4×10^(3),9.1×10^(1)和1.2×10^(2)拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10~1000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%(BCoV)、97.4%(BRV)、100.0%(BVDV)和100.0%(MCFV)。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。

仔猪腹泻病流行现状及防控技术研究进展

仔猪腹泻病在猪群中发病急、规模大、速度快,年平均发病率高,给全球养猪业带来巨大威胁,导致惨重的经济损失。仔猪腹泻病病因复杂,引起仔猪腹泻的主要病原具有能自然重组、持续变异、宿主谱广和血清型多样等流行特征。随着变异病原增多、混合感染情况严重及疫苗保护效果下降等问题的出现,迫切需要开发更灵敏准确的检测手段、更安全有效的可用疫苗和升级现有的综合防控技术。该文就仔猪腹泻病的病因、流行现状和综合防控关键技术研究进展方面进行阐述总结,提出疫病精准诊断、疫苗合理选择、加强生物安全和严格饲养管理等的综合防控措施,为诊断和防控该病提供参考依据。

成人腹泻轮状病毒组织培养的探讨

将成人腹泻轮状病毒（ＡＤＲＶ）接种恒河猴胚肾传代细胞系（ＭＡ－１０４）、非洲绿猴肾传代细胞（Ｖｅｒｏ）和原代绿猴肾细胞（ＡＧＭＫ）３种细胞，观察病毒感染细胞的整个过程。结果发现感染４８～７２ｈ后，被感染细胞出现合胞体，用免疫学方法检测证实为特异ＡＤＲＶ病毒蛋白，试图连续传代病毒但未成功。探讨从细胞水平观察病毒感染，对ＡＤＲＶ组织培养研究提供了一定的科学依据，对试图利用组织培养研制疫苗提出疑问。

基于宏病毒组学技术挖掘猪腹泻粪便的病毒群落组成

为系统鉴定现阶段上海地区仔猪腹泻样品中的病毒群落组成,本研究利用宏病毒组学技术对临床采集的猪腹泻粪便进行了宏病毒高通量测序。结果显示,测序获得了1,676,726个RNAcontig和95,111个DNAcontig,RNA病毒和DNA病毒序列分别占比38.58%和3.10%。其中星状病毒科、杯状病毒科和小RNA病毒科是病毒总群落中占比最高的前3个科。虽然DNA病毒在病毒总群落中的占比较低,但其单组分环状DNA(CRESS-DNA)病毒种类丰富多样,包含有18种CRESS-DNA病毒。经基因组序列深度拼接,共获得了46条病毒全基因组序列,包括2株猪星状病毒和3株类似星状病毒、2株札幌病毒、16株小双节RNA病毒和23株CRESS-DNA病毒。其中1株札幌病毒归属于GII/3亚型,与人札幌病毒亲缘性较近。16株小双节RNA病毒中有4株归属于GGI亚型,其余12株归属于GGII亚型。23株CRESS-DNA病毒中有1株归属于类双生病毒科、12株CRESS-DNA病毒归属于小环状DNA病毒科,另外10株CRESS-DNA病毒未分类。本研究揭示现阶段猪腹泻粪便中以RNA病毒为主导,且存在宿主多样性,提示可能存在种间基因重组,病原潜在危害性需进一步挖掘和验证。研究数据将为临床猪腹泻病防控提供参考和借鉴。

应用调整Serfling回归模型估计北京市5岁以下儿童病毒性腹泻相关超额病例数

目的构建调整Serfling回归模型，估计北京市2011年至2015年5月23日病毒性腹泻相关〈5岁儿童超额腹泻病例数。方法利用北京市2家儿童专科医院〈5岁儿童急性腹泻周就诊病例数，拟合调整Serfling回归模型，估计其病毒性腹泻相关超额病例数。结果北京市2011年第8—10周、40～42周，2012年第40～46周，2013年第43～49周，2014年第45周直到2015年第11周为病毒性腹泻流行周。2家儿童专科医院各年度流行周〈5岁儿童病毒性腹泻相关超额就诊病例数分别为911（95％C1：26I～i56I）、l998（95％CI：l250—2746）、1645（95％c，：891～2397）、2806（95％CI：1938—3674）、1822（95％CI：614～3031）例，分别占同期全部〈5岁儿童腹泻就诊病例数的40．38％（95％CI：11．57％～69．19％）、44．21％（95％CI：27．66％一60．77％）、45．08％（95％c，：24．42％一65．69％）、60．87％（95％CI：42．04％～79．70％）和66．62％（95％CI：22．45％～110．82％）。估计北京市2011年至2015年5月23日〈5岁儿童病毒性腹泻相关超额就诊病例数为18731（95％CI：10106—27354）例。结论冬季是〈5岁儿童病毒性腹泻发病及就诊高峰。调整Serfling回归模型提示：应关注致急性胃肠炎病毒，尤其是诺如病毒的病原学变化。