绵羊痘种毒保存期试验

鸡胚化绵羊痘羊体反应细胞毒(以下简称“绵羊痘种毒”)是制备绵羊痘活疫苗的基础种子,对于预防和控制绵羊痘疫情具有重要意义,定期对其检定十分必要。2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称“《规程》”)规定:绵羊痘种毒在-30℃以下,保存期为10年。为进一步探究绵羊痘种毒的保存期,本试验选取1981年1月、1983年1月、1990年4月和2006年2月冻干并于-70℃保存至今的4株绵羊痘种毒,进行病毒含量测定和最小发痘量测定。结果显示,4株绵羊痘种毒的最小发痘量均达到10^(-5)/0.5 mL,符合《规程》之规定;病毒含量分别为10^(3.3)、10^(3.8)、10^(4.8)和10^(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,且与最小发痘量在一定范围内呈正相关。结果表明,冻干绵羊痘种毒在-70℃条件下保存39年仍符合生产活疫苗的免疫原性标准,因此可将绵羊痘种毒的保存期延长至-70℃保存30年,本试验为绵羊痘种毒的保藏检定和疫苗生产提供数据支撑。

呼吸道合胞病毒感染Hep-2及Vero细胞的病变特点及易感性分析

目的比较Hep-2细胞与Vero细胞感染呼吸道合胞病毒(RSV)的病变特点、易感性,及RSV在两种细胞上产生的子代病毒的感染性。方法实验分为Hep-2空白对照组、Hep-2实验组、Vero空白对照组及Vero实验组。空白对照组未感染病毒,实验组为RSV以MOI=1感染细胞。RSV感染两组细胞后,显微镜观察细胞病变效应(CPE),免疫荧光检测RSV N蛋白表达及空斑实验测定病毒滴度,并进一步予Hep-2实验组及Vero实验组产生的子代病毒感染A549细胞,空斑实验比较子代病毒的感染性。结果Hep-2实验组感染后48 h,Vero实验组感染后84 h时均可形成明显的合胞病变,两个实验组的细胞病变特点存在明显差异,免疫荧光检测RSV N蛋白表达特点与细胞病变特点一致,两个实验组均能产生的较高的病毒滴度。但当Hep-2实验组及Vero实验组产生的子代病毒感染A549细胞,发现感染后36、48 h,两组细胞的子代病毒滴度比较,差异无统计学意义(P>0.05),感染后60 h,Hep-2实验组细胞的子代病毒滴度高于Vero实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论RSV感染Hep-2及Vero细胞后均可形成明显的合胞病变,均能达到较高病毒滴度,但RSV在Hep-2细胞上产生的子代病毒感染性明显强于Vero细胞产生的子代病毒。

小鹅瘟、鸭病毒性肝炎卵黄抗体高免蛋免疫程序的研究

试验旨在研究小鹅瘟、鸭病毒性肝炎(1型+3型)二联灭活疫苗免疫商品蛋鸡的效果,测定蛋黄中小鹅瘟琼扩抗体和鸭肝炎中和抗体,筛选最佳高免蛋制备免疫程序。试验随机将2500只产蛋鸡分成5组,每组500只鸡。A组~D组进行3次免疫(A组、B组首免和第2次免疫间隔14 d,C组、D组首免和第2次免疫间隔21 d,各组第2次免疫和第3次免疫间隔21 d),首次免疫剂量均为1.0 mL/只,第3次免疫均剂量为1.5 mL/只;A组、C组第2次免疫剂量为1.0 mL/只,B组、D组第2次免疫剂量为1.5 mL/只。E组不接种作为非免疫对照组。结果显示,第3次免疫后21 d,各组小鹅瘟抗体效价达1∶200,鸭肝炎中和抗体效价达1∶1024,均达到高免蛋使用标准。研究表明,采用首次免疫剂量1.0 mL/只,接种后21 d进行第2次免疫(剂量为1.5 mL/只),第2次免疫后21 d进行第3次免疫(剂量为1.5 mL/只)的免疫程序可获得较高的小鹅瘟和鸭肝炎抗体。

甘草主要成分抗H9N2亚型流感病毒作用研究

利用H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株感染小鼠,以肺指数抑制率、肺组织病毒滴度、死亡保护率和生命延长率为评价指标,研究了甘草酸单铵盐、甘草次酸、甘草黄酮等甘草中3种主要成分和甘草粗提物对感染H9N2亚型流感病毒小鼠的防治效果。结果表明,甘草粗提物及甘草酸单铵盐口服均能显著抑制H9N2亚型流感病毒鼠肺适应株引起的小鼠肺炎实变(P<0.01),甘草粗提物20 mg/kg组能明显延长流感病毒感染小鼠的生存时间。

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率

慢病毒载体已经广泛应用于动物模型中基因治疗的研究和转基因动物的制备,而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤.通过荧光实时定量PCR的方法定量分析重组慢病毒的颗粒数以及病毒的活性滴度,并以GFP报告基因的方法作为对照来验证定量PCR方法的准确性.研究结果显示,应用荧光实时定量PCR法与GFP报告基因法测定得到的病毒活性滴度成正相关,而且前者可以更加准确地测定病毒滴度和病毒感染效率.

猪伪狂犬病毒Real-time PCR检测方法的建立和弱毒疫苗病毒含量的检测

根据伪狂犬病毒的gB基因设计引物,将含gB基因的质粒作为标准品,绘制标准曲线,建立了伪狂犬病毒PRV的荧光定量PCR检测方法。该检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,不与PCV2、PPV、CSFV、JEV和PRRSV发生反应。用该方法对不同滴度病毒液的基因拷贝数进行检测,发现病毒滴度和病毒拷贝数之间存在较好的相关性。采用该方法对7种商品化PRV弱毒疫苗进行病毒含量检测,结果显示不同商品化弱毒疫苗的病毒含量存在显著差异,与说明书标注的病毒含量基本一致。

鼠巨细胞病毒感染小鼠感染性病毒滴度和基因表达的研究

目的观察鼠巨细胞病毒(MCMV)全身播散感染小鼠唾液腺的感染性病毒滴度,唾液腺、肝、脾和肾MCMV DNA及mRNA水平,以了解MCMV感染小鼠易感组织和器官内的病毒状况。方法 30只BALB/c幼龄小鼠腹腔接种MCMV(Smith株),在感染后1、3、7、14、28、60、75、90和120 d,各随机处死3只小鼠。噬斑法检测唾液腺感染性病毒滴度,实时定量PCR和逆转录PCR(RT-PCR)分别检测唾液腺、肝、脾和肾内MCMV DNA水平及mRNA表达。结果感染后7 d开始,噬斑法在唾液腺内检测到MCMV,14 d达到高峰,28 d以后不能再检测到;唾液腺、肝、脾和肾MCMV DNA在感染后1 d就可检测到,并持续到感染后120 d;唾液腺MCMV mRNA在感染后45 d不能检测到,而肝和肾MCMV mRNA在感染后28 d,脾MCMV mRNA在感染后14 d不能检测到。结论 MCMV感染的幼龄小鼠在感染28 d后不再排毒,在感染45 d后病毒不再复制,而在长达120 d的急慢性感染期内,病毒长期存在。

核因子κB在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用

目的探讨核因子κB(NF-κB)在病毒性心肌炎(VMC)发病机制中的作用。方法BALB/c小鼠100只,随机分成2组。对照组40只,腹腔注射MEM培养液0.1 ml;病毒组60只,腹腔注射107/ml柯萨奇B3病毒(CVB3)病毒液0.1 ml。两组在接种后第0、4、7、10天取心肌组织用Western blot法检测心肌细胞核NF-κB的含量,同时测定心肌病毒载量、心肌病理积分。结果病毒感染后第4、7、10天病毒组心肌细胞核NF-κB的含量明显高于对照组,差异有统计学意义,且与心肌病变积分呈显著正相关(r=0.985、0.965,P<0.05);第4、7天CVB3载量与心肌病理积分(坏死)呈正相关(r=0.790、0.759,P<0.05),而第10天无相关性(r=-0.058,P>0.05)。结论NF-κB在病毒性心肌炎的发病机制中有重要作用;CVB3感染可调节心肌细胞核NF-κB的含量,这种调节作用不依赖于CVB3的复制。

一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。

Vδ2 γδ T细胞亚群在慢性HCV感染中的特征

目的:探讨γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞在慢性HCV感染中的作用。方法:采用流式细胞术检测人外周血γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞比例变化。结果:慢性HCV感染病人外周血中γδT细胞及其亚群Vδ1和Vδ2 T细胞比例与健康对照者相比无显著差异。相关性分析显示HCV感染患者Vδ2 T细胞数目与肝脏损伤成正相关而与病毒滴度不相关。慢性HCV感染病人Vδ2 T细胞处于活化状态,CD107a表达高于对照组。结论:Vδ2 T细胞亚群参与慢性HCV感染所致肝损伤。

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪体内病毒动态及免疫反应的影响

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染6周龄健康仔猪,采用实时定量PCR(Real-ti me PCR)对血清、组织(心、肝、肺、肾、胰、脾、胸腺、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结)中的PRRSV和PCV2载量进行检测,分别采用间接ELISA和间接IFA对血清中的PRRSV和PCV2特异性抗体进行检测,采用MTT法对猪外周血淋巴细胞(PBLC)的增殖能力进行检测。结果,PRRSV/PCV2共感染组血清、组织中PRRSV的载量均显著高于PRRSV单感染组,PCV2的载量均显著高于PCV2单感染组;共感染组PRRSV和PCV2特异性抗体阳转的时间均晚于并且效价均显著低于PRRSV或PCV2单感染组;共感染组和单感染组PBLC的增殖能力均受到抑制,其严重程度依次为:PRRSV/PCV2组>PRRSV组>PCV2组。由此表明,PRRSV和PCV2在猪体内对彼此的增殖具有促进作用;PRRSV和PCV2共感染对猪的免疫抑制具有加重作用。

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。

天花粉蛋白对体内体外单纯疱疹病毒-1的抑制作用

目的探讨天花粉蛋白对体内体外单纯疱疹病毒-1(HSV-1)的抑制作用。方法动物随机分为模型对照组和天花粉蛋白治疗组,小鼠颅内接种HSV-1建立病毒性脑炎模型,治疗组于接种HSV-1前30min腹腔注射天花粉蛋白注射液,接种病毒后12、24、48和96h、7d分别测定各组脑组织病毒滴定度。培养神经细胞分为正常对照组、病毒对照组、药物预处理组,接种病毒后12、24、48和96h分别测定各组培养神经细胞的病毒滴定度。结果天花粉蛋白治疗组于小鼠颅内接种HSV-1后12、24、48和96h、7d脑组织病毒滴度分别为(1.32±0.39)、(1.27±0.44)、(1.33±0.41)、(1.29±0.48)、(1.16±0.45),明显低于模型组(2.91±0.55)、(2.95±0.56)、(2.93±0.54)、(2.89±0.58)、(2.89±0.44),差异有显著性(P<0.001)。药物预处理组在12、24、48和96h后培养神经细胞病毒滴度分别为(1.12±0.34)、(1.18±0.40)、(1.24±0.38)、(1.26±0.42),明显低于病毒对照组(2.65±0.64)、(2.59±0.53)、(2.83±0.55)、(2.82±0.57),差异有显著性(P<0.001)。天花粉蛋白治疗组小鼠存活率为53.3%,模型组小鼠生存率为6.7%;天花粉蛋白预处理组神经细胞存活率均明显高于病毒对照组,差异有显著性(P<0.01)。结论天花粉蛋白对体内体外单纯疱疹病毒-1具有抑制作用。

辛伐他汀对柯萨奇B_3病毒感染小鼠心肌早期的保护作用(英文)

目的探讨辛伐他汀对急性柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌早期的作用。方法将柯萨奇B3病毒感染小鼠随机分为两组:对照组(n=15)及辛伐他汀治疗组(n=15),分别给予生理盐水及辛伐他汀14 d。第6天时,各组分别随机处死6只。结果辛伐他汀治疗组其心脏质量(69±13mg)较对照组(96±16mg)减轻(P<0.01);心肌炎症及坏死程度减轻,心肌病理积分(8.0%±7.3%vs22.9%±10.6%)显著降低(P<0.01);14 d生存率明显升高(P<0.05)。结论辛伐他汀治疗可减轻心肌病理损害,对早期感染柯萨奇B3病毒小鼠心肌有保护作用。

利用鸡胚成纤维细胞培养禽脑脊髓炎病毒的研究

利用鸡胚成纤维细胞 (CEF)培养禽脑脊髓炎病毒 (AEV) ,经过六次盲传发现 :AEV在 CEF上无细胞病变 (CPE) ,但利用 CEF细胞上清接种 SPF鸡胚 ,可产生不同程度的 AE鸡胚病变。分别取不同时间的感染细胞上清 ,测定 AEV浓度 ,结合培养条件 ,进而确定 AEV培养的最佳时机。结果表明 :以 AEV在 CEF上培养 7天最好 ,病毒滴度可达 10 2 .8EID50 / 0 .2 ml。将经 CEF培养的 AEV差速离心 (浓缩约 5 0 0倍 ) ,接种 SPF鸡胚 ,可产生典型的鸡胚病变 ,其滴度为 8× 10 5.0 EID50 / 0 .2 m l。通过 Cs Cl密度梯度离心提纯病毒 ,在电镜下观察到了大小基本一致的病毒粒子 ,病毒直径约为 2 5 nm。利用 AEV感染的 CEF或通过“细胞飞片”制备荧光片 ,建立了间接免疫荧光快速检验 CEF是否感染 AEV的方法。

重组腺病毒载体pDC316-hIL--24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达h IL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。

MCMV不同途径感染免疫缺损性小鼠体内效应的研究

通过血管注射、腹下注射、唾液腺注射等3种不同途径将野生型小鼠巨细胞病毒(murinecytomegalovirus,MCMV)感染免疫缺损型小鼠CM17SCID(severecombinedimmunodeficiency,严重免疫缺损综合症),在感染后不同的时间内分别取唾液腺、脾、肝、肺和肾脏测定其病毒滴度,以及测定感染后SCID小鼠的死亡率.同时通过唾液腺注射RvM43突变株,测定病毒在唾液腺中的滴度.结果显示:经尾部血管途径注射的体内唾液腺、肺、脾、肝和肾脏的病毒滴度高峰期和SCID小鼠死亡时间均显著性早于经腹下注射、唾液腺注射途径.除唾液腺器官外,经唾液腺注射途径肺、脾、肝和肾脏的病毒的出现时间晚于经尾部血管和腹下注射途径.经唾液腺注射后,唾液腺中突变型RvM43在各时间点的病毒滴度及高峰出现时间与野生型相同.由此可知,从唾液腺感染小鼠后MCMV病毒在唾液腺中的生长不受M43基因突变的影响,小鼠巨细胞病毒不同途径感染免疫缺损型小鼠CM17SCID的体内生物学效应有差异.因此有必要通过不同途径感染宿主来研究MCMV基因的体内功能.

浙江省传染性非典型肺炎冠状病毒分离株ZJ01的细胞病变与增殖滴度

目的 观察分离自浙江省 1例早期SARS患者的病毒ZJ0 1株在Vero、Vero E6及RD细胞上进行适应 ,以及在上述几种细胞中ZJ0 1株的增殖滴度。方法 病毒增殖采用观察细胞病变及荧光染色法进行。结果 证实ZJ0 1病毒株对Vero、Vero E6及RD等细胞均敏感 ,但在几种细胞中的增殖滴度有较大的差别 ,其中以Vero E6感染滴度最高可达 10 6.0～ 7.0 ,Vero和RD细胞的增殖滴度在 10 3 0～ 4.0 。结论 本文认为SARS病毒ZJ0 1株对上述细胞均敏感 ,其中以Vero E6细胞滴度最高。

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。