VDR基因敲除鼠一氧化氮合酶和内皮素-1基因的表达

目的探讨维生素D受体(VDR)基因敲除鼠血压变化以及与血压水平密切相关的内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因在主动脉的表达情况,了解维生素D、维生素D受体与血压的联系及可能机制。方法小鼠血压采用动脉血管插管法直接测定,主动脉内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因表达采用实时定量聚合酶链式反应检测。结果内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因均能在野生型正常鼠及维生素D受体基因敲除鼠主动脉表达。与野生型正常鼠比较,纯合子维生素D受体基因敲除鼠收缩压、舒张压明显升高,主动脉内皮型一氧化氮合酶基因表达明显下调,内皮素-1基因表达明显上调(P均<0.05),杂合子维生素D受体基因敲除鼠收缩压、舒张压及主动脉内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因表达则无明显改变(P均>0.05)。相关性研究发现主动脉内皮型一氧化氮合酶基因表达水平与收缩压、舒张压水平呈负相关,与收缩压、舒张压水平呈正相关(P均<0.05)。结论纯合子维生素D受体基因敲除鼠存在与血压密切相关的主动脉内皮型一氧化氮合酶、内皮素-1基因表达水平明显异常。

维生素D受体及cathelin相关抗菌肽在肺炎支原体感染小鼠肺组织中的动态表达及作用

目的建立肺炎支原体(MP)感染BALB/c小鼠模型,探讨感染后不同时间点(感染后3、7、14、21 d)肺组织中维生素D受体(VDR)和cathelin相关抗菌肽(CRAMP)的动态变化。方法64只小鼠随机分为MP感染3、7、14、21 d组和相应对照组(每组n=8),应用HE染色观察肺组织病理改变并采用PCR进行模型鉴定;免疫组化方法测定肺组织中VDR的表达;实时PCR测定肺组织中VDR mRNA的表达;Western blot检测肺组织中CRAMP的表达。结果 MP感染后小鼠肺组织呈间质性炎性改变,肺泡间隔增宽,大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润在支气管、血管周围,肺泡内有渗出,且炎症程度于MP感染7 d表现最为严重。PCR检测支气管肺泡灌洗液中MP-DNA呈阳性表达,证明造模成功。免疫组化、实时PCR和Western blot结果显示VDR及CRAMP含量表达呈动态变化,在MP感染3 d出现一过性增加,MP感染7 d降低恢复正常,MP感染14和21 d再次增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 VDR及CRAMP可能参与了MP感染的损伤和抗损伤过程;VDR及CRAMP在肺炎支原体感染中表达变化趋于一致,提示在MP肺部感染时可能通过VDR影响CRAMP的表达。

维生素C对慢性铅暴露小鼠海马NMDAR表达的影响

目的探讨维生素C对慢性铅暴露小鼠海马N-甲基D-天冬氨酸受体(NMDAR)表达的影响。方法将健康昆明系小鼠随机分为染铅组(从出生第l天起饲以醋酸铅水溶液9.6mmol/L)、维生素C给药组(从出生第l天起饲以醋酸铅9.6mmol/L及维生素C 7.5mL/kg水溶液)及对照组(饲以不含铅的饮用水),每组9只。小鼠于出生21d后断颈处死,采静脉血检测血铅浓度,并同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其海马中NMDAR亚单位的表达水平。结果维生素C给药组小鼠的血铅浓度显著低于铅染组,但仍然高于对照组(P<0.01),维生素C给药组小鼠海马细胞的NMDAR亚单位ε1mRNA表达水平较染铅组明显提高(P<0.01),而ε2mRNA表达水平基本不变(P>0.05)。结论维生素C可降低染铅小鼠的血铅浓度,并可以影响小鼠海马NMDAR的表达水平,对海马细胞具有一定保护作用。

饲粮阴阳离子差水平对围产期小鼠血钙浓度与胃肠道组织维生素D受体mRNA表达水平的影响

本试验旨在通过研究饲粮阴阳离子差(DCAD)水平对围产期小鼠血钙浓度和胃肠道组织维生素D受体(VDR)mRNA表达水平的影响,揭示低DCAD水平防治低血钙症的作用机理。将120只围产期小鼠分为3组,每组40只,分别饲喂DCAD水平为+300(高DCAD水平组,HD组)、+150(对照组,CON组)、-150 mmol/kg DM(低DCAD水平组,LD组)的饲粮。在小鼠产前20 d(-20 d)、产前5 d(-5 d)、产仔当天(0 d)、产后3 d(3 d),每组随机选取10只采血并采集胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠样品,测定血钙浓度与组织VDR mRNA表达水平。结果表明:在整个试验期和单个采血时间点,LD组较CON组、HD组显著提高小鼠血钙浓度(P<0.05)。与CON组、HD组相比,在-20 d,低DCAD水平显著提高了空肠、回肠和结肠的VDR mRNA表达水平(P<0.05);在-5 d,低DCAD水平显著提高了空肠、结肠VDR mRNA表达水平;在0 d,低DCAD水平显著提高了十二指肠VDR mRNA表达水平(P<0.05);在+3 d,低DCAD水平显著提高了十二指肠、空肠和结肠VDR mRNA表达水平(P<0.05)。由此可见,低DCAD水平可提高围产期小鼠胃肠道组织VDR mRNA表达水平,增加血钙浓度。这可能是低DCAD水平有效防治低血钙症的作用机理。

吡格列酮对ob／ob小鼠体内维生素D受体表达的影响

目的通过观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome roliferator—activated receptor γ,PPARγ)激动剂——吡格列酮对ob/ob小鼠体内维生素D受体(VDR)表达的影响,探讨PPARγ激动剂在改善胰岛素敏感性、降低血糖的同时引起骨质疏松的可能机制。方法将ob/ob小鼠分为正常对照组(16只)及吡格列酮组(16只),分别予空白溶剂及吡格列酮(10mg·kg-1·day-1)进行干预,在第2周及第6周时观察骨量的改变,同时利用实时定量PCR检测股骨及肾脏中维生素D受体的mRNA表达量。结果吡格列酮可有效降低小鼠血糖(P<0.05),但同时也显著导致小鼠肥胖(P<0.01),并引起股骨重量的下降(P<0.01)。另外,在吡格列酮干预的过程中,随着药物使用时间的延长,股骨VDR的mRNA表达明显增加,至第6周时,吡格列酮给药组中小鼠股骨VDR的mRNA表达量明显高于正常对照组(P<0.01);而同时,吡格列酮组肾脏VDR的mRNA表达量却较对照组明显下调(P<0.05)。结论 PPARγ激动剂通过影响肾脏及骨骼中VDRmRNA的表达,从而影响骨代谢,引起骨量下降,这可能是TZDs导致骨质疏松的机制之一。

维生素D受体激动剂对模型小鼠特应性皮炎的治疗作用

目的观察维生素D受体激动剂(vitamin D receptor activators,VDRAs)对特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)模型小鼠的治疗作用并探讨其在免疫方面的作用机制。方法将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,即空白组、AD模型组和VDRAs治疗组,每组6只。用二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠特应性皮炎模型,共刺激9次。AD模型组和治疗组均需要造模。造模成功后,治疗组小鼠腹腔注射BXL-628,每2天注射1次,共注射7次;空白组和AD模型组不给予任何治疗。用测厚仪测量小鼠左耳中部厚度,肉眼直接观察小鼠腹部皮损变化。组织病理切片后显微镜下观察小鼠腹部皮肤厚度及炎细胞浸润情况。ELISA法测定各组小鼠血清中IL-4和IFN-γ水平。结果 VDRAs治疗组小鼠耳部肿胀度及腹部皮损炎症反应较模型组明显改善,血清IFN-γ水平高于模型组,血清IL-4水平低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 VDRAs可促进AD小鼠IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌,并调节Th1/Th2失衡,这可能是其对AD模型小鼠有一定的治疗作用的机制之一。

1,25-二羟基维生素D_3通过诱导基质金属蛋白酶7的表达上调小鼠肠道中活性防御素

为探索维生素D对肠道先天免疫抗菌肽——α-防御素1(alpha-1-defensin,DEFA1)剪切酶基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)的调控,利用维生素D受体基因敲除小鼠(Vitamin D receptor knock-out,VDR-KO)与肠道细胞系作为研究模型,通过免疫组化染色、q RT-PCR及免疫印迹等研究方法,发现其肠道细胞中MMP-7的转录水平与蛋白水平较野生型(wild type,WT)小鼠显著降低,并且DEFA1的表达量也较低,表明维生素D可以调控肠道MMP-7的表达,从而影响DEFA1的成熟。同时,体外细胞实验表明:1,25-二羟基维生素D_3能够上调肠道细胞MMP-7的转录水平和蛋白水平。初步表明,维生素D通过调控MMP-7的表达影响DEFA1的成熟,而维生素D缺失,MMP-7下调从而DEFA1下调,进一步可能造成肠道菌群失调,导致多种慢性疾病的发生。

EAE小鼠脑和脊髓维生素D受体蛋白表达差异研究

目的探讨在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠和健康对照小鼠不同中枢神经系统区域和在不同神经功能评分时维生素D受体(VDR)表达量的差异。方法按Weaver’s 15分神经功能评分法将EAE小鼠分为0分组、高分组、低分组,采用透射电子显微镜观察各组小鼠髓鞘结构;采用Western Blot测定EAE高分组小鼠和健康对照组小鼠皮质、白质、小脑、脑干、脊髓组织的VDR蛋白表达量;根据结果,选择在脊髓组织进一步对健康对照组与EAE各组间进行VDR蛋白表达量的比较。结果在透射电子显微镜下观察EAE 0分组、高分组、低分组小鼠髓鞘结构,对比健康对照组都有不同程度的破坏:0分组、低分组髓鞘环形结构存在,高分组髓鞘环形结构消失。在皮质、白质、小脑、脑干、脊髓组织中,EAE组的VDR蛋白表达均较健康对照组低(皮质P=0.893;白质P=0.767;小脑P=0.225),其中脑干和脊髓的VDR蛋白表达明显低于健康对照组(P=0.046;P=0.009);在脊髓组织中,EAE 0分组、高分组、低分组VDR蛋白表达都低于健康对照组(P=0.005;P=0.009;P<0.0001);高分组较0分组低(P=0.716),低分组较0分组进一步下降(P=0.003),同时低分组较高分组也呈下降趋势(P=0.013)。结论EAE小鼠不同中枢神经系统区域VDR蛋白表达有差异,不同神经功能评分组VDR蛋白表达有差异。

昆明小鼠胃肠道钙离子跨膜吸收途径相关基因表达模式分析

本研究旨在分析钙离子(Ca2+)跨膜吸收途径相关基因在昆明小鼠胃肠道中的表达模式。选取12只8周龄、平均体重(30.71±2.93)g的雌性昆明小鼠,取胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠组织样品,利用实时定量PCR法检测维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-D9k)、瞬时性受体电位通道香草酸受体6(TRPV6)和维生素D受体(VDR)mRNA表达量。结果表明:1)CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA在胃内属低水平表达,而在盲肠内表达量较高;2)随着小肠的延伸,CaBP-D9k、VDR mRNA表达量逐渐降低,而TRPV6 mRNA则在回肠内高水平表达;3)CaBP-D9k(P<0.05)、VDR(P<0.05)、TRPV6 mRNA的表达量(P>0.05)随着大肠肠段的延伸而不同程度地下降。结果提示,CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表达量与胃肠道Ca2+跨膜吸收能力存在关联性。

维生素D调节肥胖型哮喘模型小鼠HMGB1/RAGE通路和脂肪因子水平的研究

目的探讨维生素D对肥胖型哮喘模型小鼠高迁移率组蛋白B1/高糖基化终末产物受体(HMGB1/RAGE)通路和脂肪因子水平的调节作用。方法实验完成于2023年2—9月,实验平台位于嘉兴学院第二医院实验中心及嘉兴学院实验室。30只小鼠采用数字耳号进行标识,并通过耳号数字随机分为Ⅰ组(正常对照组)、Ⅱ组(哮喘组)、Ⅲ组(肥胖型哮喘组)、Ⅳ组(哮喘+维生素D组)和Ⅴ组(肥胖型哮喘+维生素D组),每组6只。单纯肥胖小鼠模型通过高脂饮食诱导,哮喘模型小鼠需采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化吸入方式诱导,维生素D干预模型小鼠则按照1 mL/d连续灌胃2周方式完成干预。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠血液中白细胞介素4(IL-4)、IL-6、IL-10、脂联素及瘦素等因子水平,使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测HMGB1和RAGE基因的表达,最后对上述结果采用SPSS进行统计学分析。结果Ⅱ组支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数(1.34±0.48)×10^(5)/L,与Ⅳ组的(4.07±0.14)×10^(5)/L比较,差异有统计学意义(t=-18.28,P<0.001);Ⅲ组BALF中白细胞计数(9.61±0.91)×10^(5)/L,与Ⅴ组的(4.89±0.38)×10^(5)/L比较,差异有统计学意义(t=11.75,P<0.001)。Ⅱ组BALF中的嗜酸性粒细胞百分比(28.75±1.94)%,与Ⅳ组的(11.51±1.99)%比较,差异有统计学意义(t=15.20,P<0.001);Ⅴ组BALF中嗜酸性粒细胞百分比为(12.50±1.42)%,与Ⅲ组的(29.80±1.96)%比较,差异有统计学意义(t=17.74,P<0.001)。ELISA结果显示,与Ⅲ组相比,Ⅴ组血清IL-4、IL-6、白介素17(IL-17)、白介素1β(IL-1β)、免疫球蛋白E(IgE)、肿瘤坏死因子α(TNFα)水平均显著降低,两组差异均有统计学意义(t=15.24、9.65、2.26、5.83、10.86、2.50,均P<0.001);Ⅲ组血清IL-10表达水平为(4.97±0.25)pg/mL,与Ⅴ组的(8.84±0.64)pg/mL比较,差异有统计学意义(t=-13.89,P<0.001);Ⅴ组血清脂联素水平为(1.95±0.85)mg/L,与Ⅲ组的(1.15±0.13)mg/L相比,差异有统计学意义(t=-12.67,P<0.001);Ⅳ组肺组织中HMGB1表达水平为1.42±0.09,与Ⅱ组的1.91±0.16相比,差异有统计学意义(t=6.55,P<0.001);Ⅳ组肺组织中RAGE mRNA表达量为1.35±0.11,与Ⅱ组的1.55±0.152比较,差异有统计学意义(t=4.19,P<0.05);Ⅴ组肺组织中HMGB1表达量为1.51±0.10,与Ⅲ组的2.44±0.10相比,差异有统计学意义(t=1.02,P<0.001)。结论维生素D可能通过上调肥胖型哮喘模型小鼠HMGB1和RAGE的表达来减轻肺损伤,这为肥胖型哮喘的治疗和预防提供了新的概念和方法。

哮喘小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路及维生素D的作用

目的观察哮喘小鼠肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)m RNA和蛋白表达变化,以及维生素D的干预作用。方法将48只BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组和1,25-(OH)2D3干预组,每组16只。建立哮喘动物模型,干预组在每次雾化激发前给予腹腔注射1,25-(OH)2D3(4μg/kg)。分别在雾化激发1周和2周采集各组标本,常规苏木精-伊红(HE)染色测定气道壁厚度;免疫组化染色观察HMGB1、TLR4和NF-κB在肺组织中的表达;采用实时荧光定量PCR和Western blot分别从m RNA和蛋白质水平检测HMGB1、TLR4和NF-κB表达变化。结果雾化激发1周和2周,哮喘组小鼠气道壁厚度较对照组明显增加,干预组较哮喘组明显减少(P<0.05);哮喘组肺组织中HMGB1、TLR4和NF-κB的m RNA表达量均明显高于对照组,干预组TLR4和NF-κB的m RNA均明显低于哮喘组(P<0.05)。雾化激发1周时干预组HMGB1 m RNA表达量与哮喘组比较差异无统计学意义(P>0.05),但在雾化激发2周时则明显下降(P<0.05)。雾化激发1周和2周,肺组织中HMGB1、TLR4和NF-κB的蛋白表达量均明显高于对照组,干预组均明显低于哮喘组(P<0.05)。小鼠气道壁厚度与肺组织HMGB1、TLR4和NF-κB的m RNA的表达量均呈正相关性(r分别为0.804、0.895、0.834;P<0.05)。结论 HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路在哮喘发病中起重要作用,适量1,25-(OH)2D3可能通过对其的调控作用阻止哮喘的进展,有望成为哮喘治疗的新选择。

维生素D受体在病毒性心肌炎小鼠心肌中的表达

目的探讨维生素D受体(VDR)在病毒性心肌炎(VMC)小鼠心肌中的表达动态变化和作用。方法选取120只4周龄雄性BALB/c小鼠,随机分为对照组(n=40)和实验组(n=80),实验组小鼠腹腔注射柯萨奇B3病毒制备VMC模型,对照组小鼠腹腔注射等量的DMEM液作为替代。分别在注射3、7、14和28 d后各处死15只实验组小鼠和10只对照组小鼠,取小鼠心脏标本。用免疫组织化学法检测小鼠心肌组织VDR的表达动态变化,并用苏木精-伊红染色观察小鼠心肌的病理变化。结果实验组小鼠接种病毒后VDR表达显著升高,并在第7天表达水平达到高峰,然后逐渐下降,在第28天仍处于较高水平(P<0.01);在第3、7、14和28天,实验组小鼠VDR表达水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);实验组小鼠心肌病理评分变化趋势与VDR表达变化趋势一致;实验组小鼠心肌VDR表达水平与其心肌病理变化呈正相关(P<0.01)。结论 VDR可能参与了VMC发病的炎性免疫过程。