2019-2022年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株基因分型及vlhA基因进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(MS)的最新感染情况,试验对2019-2022年在我国河南、河北、山东、安徽、江苏5个省份收集的152份疑似MS感染的鸡病料进行MS分离鉴定,对分离的MS菌株进行基因分型,并对其vlhA基因5′端保守区域(76~421 nt)进行遗传进化分析。结果显示:共分离到29株MS菌株,除其中1株为E型外,其余28株均为L型;29株MS均处在一个大的进化分支,与国内流行菌株亲缘关系较近,与国外流行菌株亲缘关系较远。研究提示:近四年我国流行的MS菌株相对独立,各地流行菌株同源性较高。

我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化和同源性分析

为了探究鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)在我国的遗传变异情况,试验采集北京市、河南省、辽宁省、河北省、天津市、山东省、安徽省、江苏省、湖北省、江西省10个地区疑似感染MS的发病鸡上颚裂黏液,进行MS分离、纯培养及鉴定,采用PCR方法扩增阳性分离株vlhA基因片段并对其进行测序分析,利用MEGA 7.0软件构建分离株与GenBank中28株参考株的系统发育树并分析遗传进化关系,再利用MegAlign软件分析分离株和参考株vlhA基因的同源性。结果表明:共得到17株MS分离株,其中16株的基因型为K型,1株为L型。分离株与国外不同地区的参考株vlhA基因同源性较低,在71.8%~91.8%之间;与国内不同地区的参考株vlhA基因同源性较高,在82.3%~95.9%之间。说明目前在我国流行的MS分离株的优势基因型是K型,并存在一定变异。

川西地区鸡滑液囊支原体分离株的部分生物学特性及其VlhA基因遗传进化分析

为了解鸡滑液囊支原体(MS)在川西地区的感染情况,本研究采集15个肉鸡场疑似MS感染的病鸡咽拭子、跗关节和胸部滑液囊样本共75份,对经PCR检测为阳性的样本进行MS分离,并对分离株的主要生物学特性进行研究,以及对分离株的VlhA基因进行遗传进化分析。结果显示,75份样本MS PCR阳性检出率为41.33%(31/75),11个鸡场感染该病,场阳性率为73.33%(11/15);但仅从其中3个鸡场分离到9株MS,分离株菌落与菌体形态与已知MS培养特性相符,各分离株培养浓度为10~4CCU/mL^10~6CCU/mL,分离株以5×10~5CCU接种7日龄SPF鸡胚,鸡胚于接种后7 d^9 d死亡,且分离回收到接种菌株;9株MS分离株VlhA基因的同源性为86.1%~99.9%,与参考株同源性为86.2%~95.4%,其中分离自同一鸡场的7株MS VlhA基因同源性为96.4%~99.9%;分离株VlhA基因遗传进化分析显示,其中分离自两个不同鸡场的两株MS与国内流行株的亲缘关系最近,而分离自另一鸡场的7株MS与中东地区分离的3株MS亲缘关系较近,表明MS在川西地区肉鸡场呈高感染率,MS VlhA基因变异较大。本研究为川西地区MS的进一步研究提供了基础材料和科学依据。

2016-2019年我国部分地区鸡滑液囊支原体分离株vlhA基因遗传进化分析

为了解我国鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染的最新流行情况,本研究于2016―2019年从江苏、安徽、山东、河南、河北、宁夏、黑龙江、湖北等8个省份疑似发生MS感染的鸡场采集样品,进行MS菌株的分离鉴定,结果共获得48株MS分离株。对这些分离株的vlhA基因片段测序和分析显示,其中46株均属于K基因型,另外2株分别属于A基因型和E基因型。研究结果表明,当前国内流行的MS优势基因型是K基因型,与其他国家和地区流行的基因型存在显著性差异。本研究结果为制定适合我国鸡群MS控制与净化的策略提供了必要的流行病学依据。

L型滑液囊支原体实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏的检测我国优势基因型(L型)滑液囊支原体(MS)的方法,试验针对L型MS vlh A基因核苷酸序列保守区设计引物及Taq Man-MGB探针,将PCR扩增的vlh A基因克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒vlh A-L作为阳性质粒标准品,建立实时荧光定量PCR(q PCR)方法,并检验该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示:该方法特异性良好,与C型MS-H株及其他鸡常见病原不发生交叉反应;重组质粒vlh A-L最小检出浓度为1.94×10^(1) copies/μL;组内和组间重复性变异系数均小于1%;临床样品检测结果与PCR测序结果吻合。研究表明,建立的q PCR方法特异性强、灵敏性高、重复性好,适用于检测我国L型MS感染情况,还可满足监测免疫MS-H株疫苗鸡群L型MS感染的要求。

鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。

冀南地区滑液支原体分离鉴定及耐药性分析

【目的】了解中国冀南地区滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的流行和耐药情况,为该地区防控MS感染提供科学依据。【方法】于2019—2022年采集冀南地区疑似MS感染的7个规模化鸡场样品(发病鸡的气囊、腭裂或爪垫渗出液)进行病原分离培养及PCR鉴定,对分离株进行vlhA基因分型序列分析,采用微量肉汤稀释法测定分离株最小抑菌浓度(MIC)。【结果】所采集样品中分离出9株疑似MS菌株,均可使液体培养基颜色变为橘黄,在固体培养基中菌落形态为典型的“煎荷包蛋”样;PCR鉴定及测序结果显示,9株分离株与MS HN01株相似性为100%,表明分离株均为MS;vlhA基因分型序列结果显示,9株MS富含脯氨酸重复序列(PRR)区均为35个氨基酸,属于L型,核苷酸序列相似性为99.7%~100%,与中国其他地区L型菌株亲缘关系较近,与泰国L型菌株亲缘关系较远;MIC测定结果显示,9株MS对泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素、林可霉素、沃尼妙林、泰妙菌素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、恩诺沙星的MIC 50/90值分别为0.25/0.25、0.5/0.5、0.5/0.5、1/1、≤0.016/≤0.016、0.062/0.125、1/1、2/2、4/4和32/32μg/mL。【结论】本研究于冀南地区成功分离到9株L型MS,与国内其他地区MS差异较小、遗传进化相对稳定,治疗当地MS感染可选用泰妙菌素、沃尼妙林、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素,其次为林可霉素、多西环素、土霉素。本研究结果可为当地防控MS感染提供科学依据。