基于VP6蛋白的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立牛轮状病毒(BRV)血清抗体的检测方法,从病料中克隆牛轮状病毒VP6基因,构建其表达载体,利用原核表达技术表达重组VP6蛋白,建立牛轮状病毒血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组VP6蛋白大小为40 ku,以包涵体形式表达,Western blot证实重组VP6蛋白有良好的反应原性;以4μg/mL浓度的抗原包被酶标板,一抗血清50倍稀释,酶标二抗稀释10000倍稀释,为最佳工作条件,阴阳临界值为0.233,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。建立的检测BRV抗体的间接ELISA可用于临床BRV感染的检测。

轮状病毒Vp6蛋白的免疫荧光检测

目的检测在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的重组轮状病毒(Rotavirus,RV)Vp6蛋白和RV SA11感染的MA104细胞中不同时间表达的Vp6蛋白及其分布规律。方法应用纯化的重组A组人轮状病毒TB-Chen株Vp6(rVp6)蛋白和RVSA11分别免疫豚鼠,制备抗血清,以抗rVp6豚鼠血清作为检测抗体,应用间接免疫荧光技术检测rVp6蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。分别用抗Vp6和抗RV SA11豚鼠血清检测Vp6蛋白和RV SA11株在感染的MA104细胞中的分布。结果在轮状病毒感染的MA104细胞和大肠杆菌BL21(DE3)中均能检测到轮状病毒Vp6蛋白。以抗RV SA11血清作为一抗检测感染细胞,比用抗rVp6血清检测具有更强的敏感性。结论免疫荧光试验可用于轮状病毒Vp6蛋白的检测。

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。

猪A群轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备猪A群轮状病毒(RV)VP6蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以原核表达、纯化的重组VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,r VP6-GST为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗VP6蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1F4)。MAb鉴定结果显示其抗体亚类为Ig G1型,轻链为κ链;细胞上清液及腹水效价分别为1∶12 800和1∶106。Western blot和间接免疫荧光结果显示该MAb能够与天然的VP6蛋白反应。应用肽扫描技术鉴定显示该MAb对应抗原表位核心序列为134DYIENWNLQNR144。该MAb的制备为进一步研究VP6蛋白功能和建立RV检测方法奠定基础。

猪轮状病毒重组VP6*蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

旨在建立猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)的抗体检测方法。本研究以PoRV截短的VP6*(aa149-332)蛋白作为检测抗原,建立PoRV抗体的间接ELISA检测方法。结果显示:截短的重组VP6*(aa149-332)以包涵体和可溶性两种形式存在,大小为22.5 ku。优化后的ELISA反应条件:VP6*(aa149-332)包被量为25 ng·孔^(-1),抗原4℃过夜包被,5%脱脂奶粉溶液37℃封闭2 h,待检血清1∶400稀释、37℃孵育30 min,酶标羊抗鼠IgG二抗1∶24000稀释、37℃孵育30 min,显色15 min。试验确定阴阳性临界值OD_(450 nm)=0.418,可检测到抗体的最大稀释度为1∶3200,批内和批间重复变异系数均小于10%,并具有较好的特异性。28份血清与Western blot结果符合率为96.42%。ELISA OD_(450 nm)值与中和抗体效价log2相关系数R^(2)=0.8785。综上所述,本研究建立的PoRV抗体间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于PoRV的临床血清样本抗体检测。

A群猪轮状病毒VP6结构蛋白在杆状病毒系统中的表达及鉴定

为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆状病毒杆粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rBac-PoRVA-VP6,经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示,表达的PoRVA重组VP6蛋白约45 ku,并且能够被PoRVA阳性血清识别。上述结果表明,经杆状病毒表达系统表达的重组VP6蛋白具有良好的反应原性,为建立PoRVA抗体检测技术奠定了基础。

A组轮状病毒结构蛋白VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

A组轮状病毒(rotavirus,RV)是婴幼儿严重病毒性腹泻的主要病原,VP6为轮状病毒的主要结构蛋白之一,天然VP6具有很强的抗原性和免疫原性。通过基因重组技术将A组轮状病毒T114中国地方株VP6基因克隆入转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒pBacPAK8-VP6与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6DNA共转染BmN细胞,获得重组病毒BmNPV-VP6。用BmNPV-VP6感染BmN细胞和家蚕5龄幼虫,Western blotting检测表明在BmN细胞和家蚕5龄幼虫的血淋巴中均可检测到120 kD的特异性条带,提示重组VP6蛋白在家蚕中获得表达,与VP6三体形式的大小相符合。ELISA检测结果显示,重组VP6蛋白在BmN细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中的表达分别在感染后第4天和第6天达到最高水平。VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达可为新型轮状病毒疫苗的研制提供新的途径。

猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6基因节段,并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4096000,能够与不同基因型的RVA反应,同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应,为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。

猪轮状病毒VP6重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较

用纯化的重组猪轮状病毒VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗血清,同时运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗猪轮状病毒VP6的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名C5D10。应用抗猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体和多克隆抗血清对感染猪轮状病毒的Marc-145细胞培养物进行了间接免疫荧光检测病原的比较研究。结果表明,利用所研制的抗猪轮状病毒VP6蛋白McAb进行间接免疫荧光法对病原检测具有很高的特异性。

牛轮状病毒VP6蛋白间接ELISA检测方法的建立

采用反转录-聚合酶链反应扩增了牛轮状病毒NCDV株VP6基因,将其定向插入原核表达载体pProHTa中,构建了重组表达载体pProHTa-NCDV-VP6,重组菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,目的蛋白获得表达,表达的蛋白大小约52ku,且有生物活性。以纯化的重组VP6蛋白作为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒血清抗体的间接ELISA方法,并与传统的琼脂扩散试验进行了比较。结果显示,建立的间接ELISA的敏感性较琼脂扩散试验高1×104倍。表明,该间接ELISA的建立为牛轮状病毒感染血清抗体的检测提供了一种简单、快速、灵敏的方法。

牛轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立检测牛轮状病毒（BRV）的双抗体夹心ELISA方法,本研究制备了家兔抗牛轮状病毒VP6蛋白的多克隆抗体,并以VP6蛋白为免疫原通过细胞融合和筛选获得了5株分泌抗BRV VP6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5C9、3G10、6E11、4D10和5A3。Western-blot和间接免疫荧光试验结果均表明,5株单抗与BRV具有良好的亲和性。以纯化的家兔抗BRV VP6蛋白多抗为捕获抗体,以4D10单抗为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。敏感性试验表明,该方法对BRV的最低检出量（TCID50）为9.884×10^4/mL。特异性试验结果表明,与PRV、PEDV、BPV及TGEV均无交叉反应。板间和板内重复性试验结果显示,该方法具有良好的重复性。对95份临床样品进行检测,与RT-PCR方法比较,符合率为100%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于BRV的快速检测。

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

利用酵母双杂交技术筛选草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38相互作用蛋白的研究

为探究草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38蛋白的生物学功能,利用酵母双杂交Gal4系统分别筛选了能与GCRV104毒株编码的VP6和VP38相互作用的宿主蛋白。利用RT-PCR从感染GCRV104的草鱼肾脏细胞中扩增GCRV104 s8和s10基因组片段的编码基因后,通过酶切与连接分别克隆至载体p GBKT7中,构建诱饵质粒p GBKT7-VP6和p GBKT7-VP38。对这些重组质粒进行细胞毒性和自激活检测后,分别以VP6和VP38为诱饵在草鱼酵母文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对筛选得到的阳性酵母菌落进行序列分析。结果表明,两个诱饵质粒p GBKT7-VP6和p GBKT7-VP38均无自激活作用;诱饵质粒p GBKT7-VP6筛选到7株阳性克隆,分别编码β肌动蛋白、augmin样复合体亚基2、甘露糖苷酶α2b1亚基、程序性细胞死亡蛋白6、真核翻译延长因子1γ和一个未知功能蛋白;诱饵质粒p GBKT7-VP38筛选到4株阳性克隆,分别编码剪切与多聚腺苷酸化特异性因子5、高迁移率组蛋白核小体结合结构域2、葡萄糖转运体X和蛋白酶体亚基β7。结果为进一步探究GCRV104毒株编码的VP6、VP38与宿主蛋白及其涉及的信号通路的相互作用奠定了基础。

基于轮状病毒VP6蛋白新型候选疫苗的研发进展

轮状病毒(rotavirus,RV)是一种人畜共患病原体,给畜牧业和人类健康带来巨大威胁。对RV感染的治疗,目前尚无有效药物,接种疫苗是有效防控RV性胃肠炎暴发的重要措施。目前人商品化RV疫苗均为口服减毒活疫苗,存在散毒风险及潜在安全性等问题,且该疫苗在不发达国家的免疫效力较低,因此,非复制型疫苗很可能成为主要的候选疫苗。本文以RV结构蛋白VP6为基础,对该蛋白在RV免疫应答中的作用及其在RV非复制型疫苗的研发及防治中的应用作一综述。

三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的 VP 6、 VP 7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。

结构蛋白VP4、VP6和VP7对牛轮状病毒的致病作用

牛轮状病毒是引发犊牛严重腹泻的重要病原体,其结构蛋白VP4、VP6与VP7三者的相互作用对病毒的组装与感染发挥着至关重要的作用。在病毒感染过程中,VP4可以影响VP7的抗原性,而VP7通过反向调节VP4又可以影响病毒体对宿主细胞的特异性吸附作用,此外,三者在结构上的特异性分布,不仅可以构成病毒框架和稳定VP4、VP7的空间结构,而且可以增强它们的免疫原性。所以,对结构蛋白VP4、VP6和VP7在结构上和生物学特性上的认识,对于今后在治疗和预防轮状病毒性疾病具有非常重要的生物学意义。

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV亚单位疫苗提供了参考。