Vps28基因多态性与EBV相关肿瘤易感性的关系

目的探讨Vps28基因rs2272658位点多态性与EB病毒相关肿瘤发生的相关性。方法采用飞行时间质谱技术对93例EBV相关鼻咽癌(EBVaNPC)、12例EBV阴性鼻咽癌(EBVnNPC)、87例EBV相关淋巴瘤(EBVaL)、49例EBV阴性淋巴瘤EBVnL以及100例正常对照组织中的Vps28基因rs2272658位点进行多态性检测,并采用SPSS21.0软件对实验结果进行统计分析。结果 EBVaNPC组Vps28基因rs2272658位点T等位基因频率高于EBVnNPC组及正常对照组(NC组),差异有统计学意义(EBVaNPC vs.EBVnNPC:OR=5.07,95%CI=2.08~12.36,χ~2=14.71,P<0.01;EBVaNPC vs.NC:OR=1.75,95%CI=1.13~2.72,χ~2=6.26,P<0.05)。在隐性模型中,EBVaNPC组的TT基因型频率明显高于其它两组(EBVaNPC vs.EBVnNPC:OR=13.95,95%CI=1.73~112.53,χ~2=9.626,P<0.01;EBVaNPC vs.NC:OR=2.07,95%CI=1.16~3.68,χ~2=6.21,P<0.05)。EBVaL组与EBVnL组及正常对照组间Vps28基因rs2272658位点的基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 Vps28基因rs2272658位点的基因多态性可能与EBVaNPC易感性有关,T等位基因可能为EBVaNPC发生的危险因子。

敲降VPS28基因对中国荷斯坦奶牛乳脂合成的调控

本课题组前期通过GWAS研究,发现VPS28基因在荷斯坦奶牛乳腺组织中特异性高表达,且其5′-UTR的突变位点–58C>T与乳脂性状关联,但其对乳脂性状的调控机理尚未明确。本研究为了明确VPS28基因及其突变位点–58C>T对乳脂的调控机理,首先利用启动子活性分析检测突变位点–58C>T对VPS28基因的影响,发现该突变位点显著降低VPS28基因启动子活性;然后利用RNA干扰技术敲降奶牛原代乳腺上皮细胞中VPS28基因表达量,检测VPS28通路和乳脂合成相关基因mRNA表达量以及细胞中脂肪滴形态,分析结果发现敲降VPS28基因可降低泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体通路基因和乳脂合成相关基因的表达量,并提高细胞中甘油三酯的合成,预示VPS28基因可能通过泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体途径调控乳脂生成。本研究结果在转录组水平揭示VPS28基因对乳脂合成的调控机制,为奶牛乳脂性状的分子育种研究提供参考依据。

色瓦绵羊VPS28基因的克隆、生物信息学分析及表达研究

液泡分选相关蛋白28(Vacuolar Protein Sorting-associated Protein 28,VPS28)是内吞体分选转运复合体I(Endosomal Sorting Complex Required for Transport I,ESCRTI)的组成亚基之一,通过控制细胞内多泡体(MVBs)的形成来参与长链脂肪酸、甘油三酯和分泌蛋白的转运。为探究VPS28基因在色瓦绵羊育种繁殖中的作用,本实验克隆了色瓦绵羊VPS28基因并进行生物信息学分析,测定该基因在乳腺、肌肉、心脏、小肠等10个组织中的表达。结果显示:VPS28基因编码区长度为666 bp;VPS28蛋白序列全长221个氨基酸,相对分子质量为25484.25;等电点为5.37,是细胞内一种酸性亲水性蛋白,不具跨膜结构。VPS28基因在色瓦绵羊乳腺、心脏、小肠等10个组织中都有表达,其中在乳腺和小肠中的表达量显著高于肌肉、心脏等其他组织(P<0.0001),在肌肉组织中的表达量最低。研究结果表明:VPS28基因在乳腺组织中高表达,可能与色瓦绵羊产奶性状相关。这一研究结果为VPS28基因在色瓦绵羊产奶性状的功能研究提供了参考依据。

Vps28基因敲除小鼠模型的构建及其对泌乳和免疫性状影响的研究

尽管基于QTL定位和关联分析研究挖掘了许多奶牛产奶性状候选功能基因,然而仅有少数几个基因经过体内外的功能验证。本课题组前期全基因组关联分析(GWAS)研究结果表明Vps28基因与奶牛产奶性状表型显著相关,并在奶牛乳腺组织中特异性高表达。为了深入了解该基因对泌乳性状的作用和功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了Vps28基因敲除小鼠,对其进行体内功能研究。研究结果显示Vps28基因敲除纯合型小鼠(Vps28-/-)极可能导致胚胎早期死亡,故只获得杂合型基因敲除小鼠(Vps28+/-)。敲除小鼠模型构建成功后,检测乳腺组织和脾脏组织中Vps28基因mRNA和蛋白的表达,结果显示与野生型小鼠(Vps28+/+)相比,Vps28+/-杂合型小鼠Vps28的mRNA和蛋白表达量均显著下降。进一步对母鼠的泌乳量、乳房形态和血常规进行检测,发现Vps28敲除母鼠的泌乳量下降,乳头明显凹陷,且血常规中白细胞数量、中性粒细胞数量、淋巴细胞数量和中间细胞数量显著低于野生型小鼠,推测Vps28基因不但影响泌乳,而且影响相关免疫性状。

VPS28通过泛素化信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成

旨在分析VPS28基因调控乳蛋白合成的分子机制,为奶牛泌乳性状的分子育种奠定理论基础。本研究首先利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲降奶牛原代乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中VPS28基因的表达水平,检测与乳蛋白合成、泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体通路相关的11个基因、泛素蛋白的表达水平及蛋白酶体活性;然后抑制BMECs中蛋白酶体和溶酶体的活性,检测酪蛋白相关基因、核糖体蛋白的表达水平;最后利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)比较蛋白质组学分析敲降前后BMECs的差异表达蛋白。结果表明,敲降VPS28基因后,CSN1S1、CSN2、CSN3、RPS8、UBC、PSMC3、PSMC5基因均显著上调,PSMD12显著下调;抑制蛋白酶体后,CSN1S1、CSN2、CSN3显著上调,RPL13显著下调;抑制溶酶体活性后酪蛋白相关基因表达不显著;iTRAQ结果共筛选出129个差异表达蛋白,下调蛋白主要富集在核糖体、溶酶体、剪切体等相关通路,上调蛋白主要富集在内质网的蛋白质加工、加压素调控的水重吸收过程、RNA转运等通路中。研究表明,VPS28基因可通过泛素化信号通路影响BMECs中乳蛋白的合成。

白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建

用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒(WSSV)。设计并合成引物 ,提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板 ,通过PCR ,扩增克隆出VP28基因 ,利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体 pUC19的多克隆位点上 ,得到VP28基因的重组克隆质粒,对其进行双向DNA测序。测序结果表明,该基因含有615个核苷酸 ,与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100 %。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游 ,EcoRI酶切鉴定 ,得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体 ,命名为 pRL VP28。

对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP28的原核表达和性质研究

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus ,WSSV)的一个重要的囊膜蛋白。为了便于研究VP2 8在和宿主细胞相互作用过程中扮演的角色 ,将VP2 8基因克隆到一个原核表达系统 ,对原核表达的VP2 8的特性进行了研究 ,并制备了抗VP2 8的多克隆抗体和单链抗体 ,对原核表达的和天然病毒的VP2 8蛋白免疫原性进行了比较。结果表示 ,原核表达的VP2 8与天然蛋白具有相似的免疫原性。

枯草芽孢杆菌表达的VP28对南美白对虾免疫力和抗病毒感染的影响

对虾白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）引起世界范围内养殖对虾的急性、致死性传染病,造成对虾养殖业的巨大经济损失。WSSV是一种具有囊膜的双链DNA病毒,属于Nimaviridae科Whipovirus属[1]。研究表明VP28是最主要的与病毒系统性感染有关的囊膜蛋白，在病毒黏附与入侵中起着关键作用.

转vp28蓝藻口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及免疫反应的影响

为探讨转vp28蓝藻(Anabaena sp.PCC7120)口服剂对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力及其相应的免疫反应,本研究将此口服剂免疫幼虾7 d,再分别通过投喂攻毒和浸泡攻毒,测定其存活率及相应的免疫指标。投喂攻毒和浸泡攻毒的实验组存活率分别为78.8%和83.19%,表明该口服剂能显著增强对虾抗白斑综合征病毒的能力。蓝藻口服剂免疫对虾的酶活性检测结果显示,超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、过氧化氢酶(CAT)和碱性磷酸酶(AKP)活性在免疫后2 h均有上升趋势,且在48或96 h达到最高值,这表明该口服剂能引起对虾体内酶活性变化。投喂攻毒的对虾酶活性检测结果显示,实验组攻毒后的对虾肝胰腺SOD活性分别比阳性对照组、野生型组、空载体组显著提高42.10%、32.26%和16.04%,且攻毒后的肌肉SOD活性分别比阴性对照组、阳性对照组、野生型组和空载体组略微提高17.70%、11.50%、15.00%以及10.00%。实验组攻毒后的对虾肝胰腺PO、CAT和AKP活性比阳性对照组分别提高12.17%、88.80%和240.07%,比野生型组分别提高21.49%、30.90%和100%;酸性磷酸酶(ACP)活性比阴性对照组略微提高,而在肌肉中各组ACP活性无显著性差异。同时浸泡攻毒组结果与投喂攻毒组具有类似的趋势。浸泡攻毒的实验组CAT和AKP活性显著高于其余处理组,且CAT活性比投喂攻毒更为显著。浸泡攻毒的实验组肝胰腺PO活性显著高于阳性对照组、野生型组和空载体组,而各组肌肉ACP活性无显著性差异。研究表明,转vp28蓝藻口服剂能够增强凡纳滨对虾抗病能力并延缓对虾死亡。转vp28蓝藻PCC7120本身可作为幼虾饵料直接投喂,无需提取纯化,有望大规模应用于对虾养殖产业。

自然养殖水体投喂CpG ODN和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗WSSV的免疫保护作用

用添加CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)和表面展示VP28的解脂耶罗维亚酵母(VP28-yl)的饵料投喂凡纳滨对虾,进行田间中试实验。投喂30 d后进行WSSV感染实验,评估其对凡纳滨对虾的免疫保护作用。投喂实验结束后,CpG ODN投喂组对虾的相对增重率达到(65.8±7.8)%(P<0.05),这暗示CpG ODN可能具有促生长作用。WSSV攻毒后,CpG ODN和VP28-yl投喂组对虾中WSSV拷贝数与对照组相比均显著降低(P<0.05),相对免疫保护率分别可达到26.7%和36.7%。在投喂结束和WSSV刺激后,CpG ODN组对虾中的呼吸爆发水平均显著升高(P<0.05)。而在VP28-yl投喂组,WSSV引起的细胞凋亡则显著受到抑制(P<0.05)。此外,WSSV刺激后,STAT基因在CpG ODN组和VP28-yl组对虾中的表达水平均显著上调(P<0.05),分别在第5天和第3天达到最大值,而对照组中则显著下调。研究结果表明,CpG ODN和VP28-yl增强了凡纳滨对虾抗病毒免疫力,对养殖对虾病毒性疫病的防控具有显著作用,可以作为免疫增强剂添加在饵料中,具有在养殖生产中推广使用的前景。

温度影响对虾白斑综合症病毒增殖机制的研究

已有文献报道温度是影响虾类感染对虾白斑综合症病毒(WSSV)的重要因素但并不清楚其机制.在本实验中我们通过定量检测病毒拷贝数后发现环境温度与病毒增殖速度有相关性.当温度在21～30℃之间时病毒增殖速度最快,病虾于感染后6～8 d全部死亡而高温(33℃)及较低温度(15～18℃)对病毒的增殖均具有一定的抑制作用,虾存活时间超过了14 d;当温度降至12℃或8℃时病毒增殖受到明显抑制,虾存活时间长达40 d.通过激光共聚焦显微镜观察进一步发现病毒进入宿主细胞的能力与温度密切相关,高温(33℃)和低温(12℃)下病毒进入细胞的数量明显比27℃时少;而通过对病毒ie1和vp28基因的转录分析发现与27℃相比,高温(33℃)和低温(12℃)明显改变了病毒基因的转录.本实验结果表明温度影响WSSV基因组的复制、转录及病毒入侵细胞的能力从而导致了病虾死亡时间上的差异.

对虾白斑综合症病毒VP28基因在家蚕体内的表达

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus,简称WSSV)的囊膜蛋白。在克隆了VP2 8基因的基础上 ,成功构建了重组转移载体pBlueBacHisC vp2 8和重组杆状病毒HyNPV VP2 8。用重组病毒的细胞培养液注射接种 5龄饷食后的家蚕 ,剪病蚕腹足采血淋巴 ,进行SDS PAGE和Westernblotting分析 ,结果表明 ,WSSV VP2 8基因在家蚕体内得到了表达 ,特异性条带大小约为 31kD。研究结果为探讨WSSV感染对虾的分子机制打下了基础。

对虾白斑病毒VP28基因在聚球藻中的表达与分析

通过PCR从实验室保存的pMD-VP28质粒中扩增得到对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28基因,同时在设计的引物起始密码子前添加促进外源基因在蓝藻中表达的SD序列,引物末端添加限制性内切酶位点BamHⅠ和EcoRⅠ,从质粒pRL-439获得强启动子PpsbA,酶切连接构建了pDC-VP28高效表达穿梭载体.利用三亲接合转移成功地将构建的载体pDC-VP28转化聚球藻7002.对转基因聚球藻进行培养,其表达产物通过SDS-PAGE分析,发现表达量达3%左右.

对虾白斑综合征病毒vp28基因的表达及其与血细胞的结合

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28并转化大肠杆菌E.coli。用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期大小31kDa相符合的目的蛋白。荧光显微镜方法分析显示,表达的VP28可与克氏原螯虾血细胞结合。结果表明,在合适的培养条件下,构建的重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28不仅能够表达vp28基因,而且表达的VP28具有很高的抗原结合活性。

对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立

用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株(2G9,3E5)可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗(3E5)包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白。用Ni2+-柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用,而且注射效果更好。

RNA干扰南美白对虾白斑病毒VP28基因的体外研究

为方便筛选VP28特异性siRNAs,通过构建真核表达载体pEGFP-VP28,然后将设计的siRNA与pEGFP-VP28共转染BHK细胞,并采用Western blotting检测GFP-VP28融合蛋白的表达情况以及半定量RT-PCR检验siRNA抑制VP28转录的效果,建立了体外RNA干扰法筛选系统。结果表明,pEGFP-VP28能在BHK细胞正常表达,设计的3对siRNA对VP28的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,其中siRNA2的干扰效果最为显著。研究结论为开展RNA干扰在对虾体内抑制WSSV的研究建立基础。

家蚕蛹表达的重组Vp28疫苗对克氏原螯虾的抗病毒保护效应

对虾白斑综合症病毒(WSSV)的致病性强、危害性大、地域分布和宿主范围广泛,目前还不能有效地控制疫情。将含有WSSV囊膜蛋白Vp28基因的重组杆状病毒HyNPV-Vp28感染家蚕(Bombyx mori)蛹,对发病蚕血淋巴进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明Vp28在家蚕体内得到了表达。将重组病毒囊膜蛋白rVp28疫苗配制成药饵,持续口服免疫75天,对克氏原螯虾进行预防WSSV,实验虾分为2%重组Vp28疫苗、2%普通蚕蛹组织匀浆(阳性对照)和普通饵料(阴性对照)3个处理组。免疫35天后进行口服攻毒,20天内rVp28疫苗组的累积存活率为63.33%,与阳性和阴性对照比差异显著(P<0.05),PRP分别达54.16%和59.26%;注射攻毒后20 天内rVp28疫苗组的累积存活率与阳性和阴性对照组比差异不显著(P>0.05),PRP分别为46.12% 和49.99%。第55天对存活虾再口服攻毒,20天内rVp28疫苗组与阳性和阴性对照组比累积存活率差异显著(P<0.05),PRP分别为55.80%和63.16%;二次注射攻毒后,rVp28疫苗组的PRP均为31.25%。对vVp28疫苗组存活虾的胃、肠和肝胰腺组织进行病毒的原位杂交检测均呈阴性反应,而对照组死亡虾组织都呈阳性反应。本研究表明,口服免疫家蚕蛹表达的病毒囊膜蛋白Vp28能诱导螯虾产生抗病毒保护作用,对应用疫苗预防对虾的病毒性疾病具有重要意义。

溶藻弧菌肽聚糖和vp28-siRNA对凡纳滨对虾白斑综合征病毒的抑制作用

对感染白斑综合征病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)分别注射0.05和0.10μg/μL的vp28-si RNA,干扰效果实验表明,si RNA最佳浓度为0.10μg/μL。凡纳滨对虾感染WSSV 24 h时注射0.10μg/μL的vp28-si RNA,检测免疫后不同时间点的干扰效果。结果表明:在注射vp28-si RNA 6 h后,实验组与对照组WSSV病毒拷贝数差异有统计学意义(P<0.05);在48 h时实验组病毒拷贝数急剧下降,对照组则保持较高水平,可较好干扰WSSV病毒复制,干扰效果持续120 h,对凡纳滨对虾的保护率为40%。凡纳滨对虾用0.10 mg/m L肽聚糖(Peptidoglycan)免疫24 h后感染WSSV,检测6、12、24 h注射vp28-si RNA的保护率。结果显示:6 h注射组的保护率为80%,12 h注射组为63.33%,24 h注射组为56.67%。凡纳滨对虾在肽聚糖和vp28-si RNA作用后,可增加其对WSSV抗感染作用,降低死亡率,干扰时间越早,对对虾的保护率越高。

对虾白斑综合征病毒VP28基因在大肠杆菌中的表达

在已构建重组质粒pGEM-vp28的基础上,通过NcoⅠ,HindⅢ双酶切质粒pGEM-vp28和表达载体质粒pET-30a,分别获得携带限制性内切酶粘性末端的vp28基因片段和表达载体质粒片段,两片段经T4DNA连接酶连接获得了重组表达质粒pET30a-vp28,将此重组质粒导入表达宿主菌EscherichiacoliBL21中,用IFID诱导表达4h后,其表达产物在SDS-PAGE和Westernblot中的显示的特异性条带大小约27ku,与预期的大小相近。