牛支原体HB0801株VspX蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)VspX蛋白单克隆抗体,将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化,作为免疫原,以QuickAntibody-Mouse 5W为免疫佐剂,免疫BALB/c小鼠。经3次免疫后,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆筛选后,共获得5株能稳定分泌抗VspX蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A8、3A3、3C12、3H9及4D11。亚型鉴定表明,3C12重链为IgG2b,其余4株为IgG1,轻链均为κ链。间接ELISA结果表明,5株细胞培养上清的抗体效价在1∶1×104~1∶2×105,腹水效价在1∶1×105~1∶8×105。选其中两株杂交瘤细胞株3H9和4D11的腹水纯化,进行亲和力测定,解离常数分别为6.3×109和7.8×109,属高亲和力抗体。Western blotting结果显示,5株单抗均能与牛支原体发生特异性反应,而单抗4D11与羊无乳支原体标准株PG2和丝状支原体丝状亚种标准株PG3均不反应。流式细胞术结果表明,单抗4D11与牛支原体表面的VspX的结合呈剂量依赖性。间接免疫荧光结果表明,单抗4D11可以识别黏附到胚胎牛肺细胞上的重组VspX蛋白。本试验成功制备的单克隆抗体为VspX蛋白功能的研究奠定基础。

牛支原体VspX蛋白黏附特性解析

为进一步解析牛支原体(Mgcoplasma bovis)VspX蛋白的黏附特性,采用间接免疫荧光法检测VspX蛋白在M.bovis中的分布,通过黏附试验和抗体黏附抑制试验检测VspX蛋白的黏附性,采用ELISA方法进一步分析VspX蛋白和突变株结合纤连蛋白(Fn)的特性。结果显示,M.bovis VspX蛋白位于M.bovis菌体表面;重组VspX蛋白(rVspX)能黏附到EBL细胞表面,且M.bovis VspX基因缺失突变株(M.bovisΔVspX)体外黏附EBL细胞能力与M.bovis野生株(M.bovis WT)相比显著下降,两个结果说明rVspX蛋白具有黏附特性;并且抗rVspX蛋白单抗能抑制M.bovis黏附EBL细胞,进而证实rVspX蛋白黏附的特异性;此外,rVspX蛋白与Fn呈剂量依赖性结合,且M.bovisΔVspX结合Fn能力与M.bovis WT相比显著下降,证明M.bovis VspX蛋白与Fn为特异性结合,且Fn分布在EBL细胞表面。以上结果表明,M.bovis VspX蛋白是一种具有Fn结合特性的黏附相关蛋白,能通过EBL细胞外基质成分Fn介导其黏附EBL细胞。