中国野生种葡萄及种间杂种VvmybA1基因型和表达分析

【目的】检测中国野生种葡萄以及山欧杂交品种VvmybA1基因型,并对不同材料VvmybA1基因序列进行比对分析,通过对山欧杂种VvmybA1的基因型和表达分析,揭示白色杂交品种‘熊岳白葡萄’果皮无花色苷合成的分子机理。【方法】设计特异性引物,在DNA水平上利用分子克隆手段和绝对荧光定量PCR方法,检测葡萄属的不同样品VvmybA1基因型。采用相对荧光定量PCR手段,对山欧杂交品种果实转色过程中VvmybA1和UFGT的表达量进行分析。【结果】①检测的中国野生种葡萄材料不存在VvmybA1a等位基因;②与欧亚种葡萄相比,中国野生葡萄VvmybA1基因在启动子、内含子以及第三个外显子区域存在不同程度碱基的缺失、插入和替换,表现出丰富的遗传多样性。而且许多野生种葡萄VvmybA1基因的内含子、外显子和启动子区域存在一些特有序列或突变,这些位点可筛选作为鉴别葡萄种和品种的分子标记;③在‘公酿1号’、‘北红’、‘熊岳白葡萄’等山欧杂交葡萄品种以及分类地位未定的‘宿晓红’葡萄中检测到VvmybA1a等位基因,并且‘熊岳白葡萄’为VvmybA1a纯合类型;④RT-PCR分析结果表明,在葡萄果皮转色过程中,‘公酿1号’葡萄果皮VvmybA1和UFGT的表达量增加,然而在‘熊岳白葡萄’果实成熟期未检测到VvmybA1和UFGT的表达。【结论】证明VvmybA1a等位基因是欧亚种葡萄以及其杂交种独有的基因型,不存在于中国野生种葡萄中,推测‘宿晓红’葡萄具有欧亚种葡萄血缘;葡萄属不同种的VvmybA1基因序列比对分析揭示,山欧杂交品种‘熊岳白葡萄’果皮不能合成花色苷是由于VvmybA1a纯合,VvmybA1不表达。

山葡萄及其杂种Myb相关基因的基因型及VvmybA1片段的分析

【目的】确定不同类型山葡萄及其杂种的Myb相关基因的基因型,分析其VvmybA1基因片段的差异,探讨山葡萄之间的遗传差异。【方法】以10个单性花山葡萄株系(品种)、3个两性花山葡萄株系(品种)、7个山欧杂种品种为材料,以欧美杂种‘巨峰’及欧亚种品种‘黑比诺’作参照,对调控花色苷合成的多个Myb转录因子的基因型进行鉴定,通过克隆VvmybA1基因片段并进行序列比对,对不同材料的VvmybA1基因片段进行进化树的构建。【结果】山葡萄中只有VvmybA1基因;欧亚种‘黑比诺’、欧美杂种‘巨峰’和山欧杂种‘北玫’和‘北方’中有VvmybA1a基因;山欧杂种‘北红’中有VvmybA1和VvmybA3基因;山欧杂种‘北醇’、‘北玫’、‘北方’和‘公酿一号’中有VvmybA1、VvmybA2和VvmybA3基因。山欧杂种‘左红一’和‘左优红’中存在VvmybA1和VlMybA2基因。山葡萄及山欧杂种VvmybA1基因片段的序列对比显示,在该基因的第3个外显子区域不存在碱基的插入和缺失但存在较多的碱基替换。【结论】不同类型山葡萄在Myb相关基因的基因型上具有一致性,都只有VvmybA1基因,并且VvmybA1基因片段序列在第3个外显子区域存在较大差异,表现出丰富的遗传多样性。两性花山葡萄株系‘双庆’应该是山葡萄内部变异产生的。不同的山欧杂种在Myb相关基因的基因型上具有较大差异。

‘蛇龙珠’葡萄新株系遗传多样性的SSR、ISSR和VvmybA1基因片段分析

【目的】探究‘蛇龙珠’8个新株系的亲缘关系和遗传多样性,选育出具有推广价值的‘蛇龙珠’新株系。【方法】以‘蛇龙珠’8个新株系(E01~E08)为样品,近缘品种‘品丽珠’‘赤霞珠’等为对照,利用SSR、ISSR分子标记和VvmybA1基因序列进行遗传多样性和亲缘关系分析。【结果】利用14对SSR引物对10份葡萄材料进行基因组DNA的扩增,通过聚类分析得出只有‘蛇龙珠’E06与其他7个株系有差异,另外7个株系聚为一类。利用11个ISSR引物进一步研究得出,‘蛇龙珠’E02(栖霞北)和E03(栖霞南)聚为一类,遗传距离与地理距离一致,E05(莱山)和E08(开发区)聚为一类,E01、E04、E06、E07之间差异显著。分析VvmybA1基因片段的差异探讨‘蛇龙珠’8个新株系的遗传差异,得出‘蛇龙珠’E01、E02、E04、E05、E06、E07的VvmybA1基因亲缘关系较近,聚为一支。‘蛇龙珠’E08和E03的VvmybA1基因分别单独聚为一支。【结论】利用SSR和ISSR可以显示‘蛇龙珠’8个新株系的亲缘关系,在区别‘蛇龙珠’8个株系时首先考虑遗传距离而不是地理距离。这些葡萄样品的VvmybA1基因片段的遗传多样性较低,在近期进化史上VvmybA1基因较稳定,在过去一段历史未发生种群扩张。

不同葡萄品种的VvmybA1基因型及其特征性DNA片段的序列分析

对59个葡萄品种的VvmybA1基因型进行了研究,发现在所有果皮为红色或紫黑色的葡萄品种中,除了‘黑奇’为VvmybA1c的纯合型外,其它都是VvmybA1a与VvmybA1b或VvmybA1a与VvmybA1c的基因位点的杂合状态。大部分果皮为白色的品种为VvmybA1a纯合型,但有7个果皮呈白色的品种基因位点为VvmybA1a与VvmybA1b或VvmybA1a与VvmybA1c杂合型。相关特征性DNA片段序列分析发现葡萄品种间存在个别碱基的差异。

葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

【目的】MYBA1转录因子在花色苷生物合成中扮演着重要角色,通过对葡萄果实发育过程中VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR的表达和花色苷的积累模式以及VvMYBA1与VvUFGT、VvDFR作用机制的分析,阐明花色苷合成调控机制。【方法】利用实时荧光PCR检测VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中的表达模式;采用分光光度计测定葡萄中花色苷积累量的变化规律;用SAS8.0软件分析VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR不同时期表达量及花色苷积累量之间的相关性;通过酵母杂交系统检测VvMYBA1转录激活活性及其与VvUFGT、VvDFR间的作用。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR在葡萄果实发育过程中呈现先上升后下降的趋势,在转色期(花后60—80 d)达到最大值。葡萄果实发育过程中花色苷积累量表现为先上升后趋于稳定,转色期(花后80d)达到最大值。相关性分析结果表明,VvMYBA1表达量与VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,花色苷积累量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关。酵母杂交系统检测表明,VvMYBA1具有转录激活功能,能够特异结合VvUFGT、VvDFR启动子,与VvUFGT、VvDFR编码的蛋白不具有相互作用。【结论】花色苷含量与VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达量呈显著正相关,VvMYBA1具有转录激活功能且能特异性结合VvUFGT、VvDFR的启动子,表明VvMYBA1通过激活VvUFGT、VvDFR的启动子来调节其表达,从而调控花色苷的合成积累。

不同颜色刺葡萄花色苷合成相关基因的表达分析

【目的】探索不同果皮颜色中国野生刺葡萄(Vitis davidii)花色苷合成相关基因的表达差异,为中国野生刺葡萄资源的利用奠定基础。【方法】以白色及黑色果实的中国野生刺葡萄、欧亚种葡萄‘白比诺’及‘黑比诺’为材料,利用HPLC-ESI-MS/MS分析不同发育期果皮中花色苷的组成及其含量,通过序列检测分析几种刺葡萄Vvmy-bA1基因序列的不同,用实时荧光定量PCR检测花色苷合成相关结构基因表达的差异。【结果】锦葵色素葡萄糖苷(Malvidin 3-O-glucoside)仅在黑色果实转色后被检测到,其在中国野生刺葡萄黑色果实和‘黑比诺’中的含量分别为0.12～7.14mg/kg与4.90～180.79mg/kg,其他花色苷如矢车菊素3,5-O-双葡萄糖苷(Cyanidin 3-O-glucoside-5-O-glucosid)、飞燕草素3-O-葡萄糖苷(Delphinidin 3-O-glucoside)、花葵素3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin 3-O-glucoside)、矮牵牛色素3-O-葡萄糖苷(Petunidin 3-O-glucosid)等在黑、白色葡萄果实不同发育期均能检测到,其含量为0.01～49.28mg/kg。VvmybA1a等位基因在中国野生刺葡萄黑、白色果实中都存在,且序列与欧亚种一致;VvmybA1c等位基因只在中国野生刺葡萄黑色果实中可检测到,与欧亚种相比其序列有33bp的插入片段和47bp的缺失片段。My-bA1基因只在黑色果实成熟期表达;合成花色苷的关键结构基因UFGT在供试葡萄各个时期均有表达,但其表达量在黑色果实成熟期显著高于白色果实;F3′5′H、GST及OMT等结构基因也在黑色果实成熟期表达上调,而其他结构基因的表达则在中国野生刺葡萄和欧亚种之间表现出了较大差异。【结论】中国野生刺葡萄花色苷合成相关基因具有特殊结构,与欧亚种葡萄相比有明显差异。

葡萄‘小白玫瑰’及其突变品种‘小红玫瑰’果皮颜色变异机理分析

‘小红玫瑰’葡萄是源自于‘小白玫瑰’的突变品种,二者都是优良的酿酒葡萄品种,但其果实颜色变异的分子机理尚不清楚。用12对SSR(Simple sequence repeats)荧光标记特征引物对两品种进行分析,结果表明这些位点在二者之间无差别。对色泽变异决定基因Vvmyb A1的基因型进行分析,‘小白玫瑰’仅检测到含有插入逆转座子Gret1(grapevine retrotransposon 1)的VvmybA1a,说明其为VvmybA1a/VvmybA1a纯合体;而‘小红玫瑰’检测到了Vvmyb A1a和残留Gret1 3′-LTR(long terminal repeat)的VvmybA1b,说明其为VvmybA1a/VvmybA1b的杂合体。花色苷合成相关基因的表达分析表明,VvmybA1、UFGT、F3′5′H、CHS、GST和OMT在‘小红玫瑰’及有色对照品种‘黑比诺’中大量表达,而在‘小白玫瑰’和无色对照品种‘白比诺’中几乎不表达。通过HPLC–ESI–MS/MS对花色苷主要成分进行测定,结果表明矢车菊素3–O–葡萄糖苷(CyG)、矢车菊素3,5–O–双葡萄糖苷(Cy2G)、飞燕草素3–O–葡萄糖苷(DpG)、锦葵色素3–O–葡萄糖苷(MvG)、芍药色素3–O–葡萄糖苷(PnG)和矮牵牛色素3–O–葡萄糖苷(PtG)等6种花色苷在有色品种‘小红玫瑰’和‘黑比诺’果皮中的含量均显著高于无色品种,花葵素3–O–葡萄糖苷(Pg G)、花葵素3,5–O–双葡萄糖苷(Pg2G)在有色/无色品种间无显著差异,且含量很低。说明‘小红玫瑰’的着色是由于转录因子基因Vvmyb A1及其调控结构基因的表达引起的,而无功能的VvmybA1a等位基因突变为有功能的VvmybA1b等位基因是其果皮颜色变异的遗传学原因。