葡萄钾离子转运基因VviHKT1;7在盐胁迫下的功能鉴定

【目的】探讨VviHKT1;7在葡萄抗盐机制中的作用,为后续培育抗盐品种提供理论参考。【方法】利用DANMAN和MEGA软件对葡萄HKT进行生物学信息分析。以抗盐性较强的砧木SA15和SA17以及生产上常用砧木1103P组培苗为材料,用100 mmol·L^(-1) NaCl分别处理0、3、6、12、24和48 h,以清水处理相应时间为对照,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HKT1在葡萄根部的相对表达量;以SA17的cDNA为模板克隆基因,连接表达载体pRI101-AN-GFP,利用农杆菌侵染法侵染拟南芥花序,在抗性MS板上筛选直到获得T3纯合株系;将野生型与转基因拟南芥种子播种于MS板和含有150 mmol·L^(-1) NaCl的MS板上,观察其发芽和生长情况并统计根长及鲜重;利用发根农杆菌技术获得SA17转基因葡萄根系,100 mmol·L^(-1) NaCl处理24 h后,利用基于非损伤微测技术的NMT活体生理检测仪检测野生型和转基因葡萄根系Na+的净流量以及盐胁迫下K+瞬时流量。【结果】多序列比对和系统进化树分析表明,葡萄HKT之间同源性较高,其中VviHKT1;7开放阅读框序列长度为1 380 bp,与VviHKT1;6的亲缘关系最近。盐胁迫显著诱导了葡萄HKT1在3个品种中的表达,其中VviHKT1;7的相对表达量上调较高,长时间胁迫后表达量仍有上升趋势,胁迫6或12 h时表达量达到峰值,且在耐盐性强的SA17、SA15中表达量明显高于1103P。拟南芥的发芽与生长结果表明,正常情况下野生型和转基因拟南芥的发芽和生长情况无显著差异,但盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率、根长、鲜重明显高于野生型。荧光检测结果表明,转基因葡萄根系在荧光下可以明显看到绿色荧光,而野生型根系检测不到荧光;进一步qRT-PCR检测结果表明,转基因葡萄根系中VviHKT1;7的表达量是野生型根系的20多倍。离子流速检测结果表明,正常情况下野生型和转基因根系Na+净流量显示出外排,各个时间段的波动幅度较小且无显著差异,平均净流量分别为208和205 pmol·cm^(-2)·s^(-1);盐胁迫后,两者Na+净流量明显增大,各个时间段的波动幅度增大,平均净流量分别为1 053和1 340 pmol·cm^(-2)·s^(-1)。正常情况下两种根系K+吸收与外排处于动态平衡状态,盐胁迫显著诱导K+外排,转基因根系的外排量明显小于野生型,分别为406和952 pmol·cm^(-2)·s^(-1),表明转基因植株根系的Na+外排、K+保持能力明显大于野生型。【结论】VviHKT1;7在葡萄响应盐胁迫中发挥着重要作用,过表达该基因可以提高拟南芥和葡萄根系在盐胁迫下的适应能力。

葡萄VviHKT1;1基因启动子的克隆与表达分析

HKT1;1转运蛋白是一类具有Na^(+)转运功能的蛋白,在植物抗盐中起关键作用。为了探究葡萄中VviHKT1;1基因在盐胁迫下的表达模式,用荧光定量PCR技术检测了VviHKT1;1在不同盐浓度,不同组织及不同处理时间的表达量,发现VviHKT1;1在葡萄茎中的表达量远高于根和叶;不同盐浓度处理后,VviHKT1;1在根和茎中的表达量随着盐浓度的升高而显著降低,叶中除100 mmol·L^(-1)NaCl外,其余盐浓度下表达量稍有升高;盐处理2 d后,VviHKT1;1表达量在葡萄根和茎中明显降低,但在葡萄叶片中随着盐胁迫时间延长显著升高。随后,克隆了VviHKT1;1上游1620 bp启动子序列,通过PlantCARE预测发现该区域有多个激素和逆境响应元件。用该启动子与GUS报告基因融合构建植物表达载体,并转化拟南芥,通过GUS染色与荧光定量分析了启动子对盐胁迫的响应。结果一致显示,GUS主要分布在地上部分,并且在盐胁迫后GUS在叶中的表达量比根中有明显增加。因此,我们推测盐处理后,地上部分可以加强VviHKT1;1表达将地上部分较多的Na+再回流到根,以降低地上部分的Na+积累缓解盐害。