猪带绦虫45W基因家族cDNA克隆和序列分析

根据猪带绦虫45W基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对六钩蚴总RNA进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收,与载体pGEMT-easyVector连接,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,测序。结果显示,已成功克隆到重要保护性抗原45W基因B型转录本cDNA,完整开放阅读框(ORF)的大小为459bp。序列同源性分析与比较表明,所获得的9个B型转录本cDNA除TSO45W-4B-1和TSO45W-4B-2与已报道的TSO45W-4B同源外,其余均属于首次报道的45W基因家族新成员。各cDNA克隆之间核苷酸序列的差异性为1.5%～19.8%,氨基酸序列之间的差异性为2.6%～29.7%,后者比前者的差异程度更大。

带科绦虫45W基因的研究进展

45W基因是带科绦虫重要的疫苗候选基因。本文就45W基因的结构、45W编码蛋白的结构特征、45W抗原疫苗免疫应答特点以及今后的研究方向作了全面、系统的综述。

新城疫病毒V和W基因真核表达产物对DF-1细胞凋亡的影响

将含新城疫病毒（NDV）疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因的真核表达质粒pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W转染鸡胚成纤维细胞（DF-1）。转染24h后，用荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP在细胞中显著表达。分别于转染后24、36h和48h用流式细胞仪测定表达产物对DF-1细胞凋亡的影响。结果表明，随着转染时间的增加，细胞早期凋亡率逐渐上升。在质粒转染后24h ， pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表达产物诱导DF-1细胞的凋亡率在14 T.26％～17.09％之间，差异不大，但都明显高于空载体组。而在质粒转染后36h ，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表达产物诱导细胞凋亡率分别为45.05％和43.4％，明显高于pEGFP-La V 和pEG-FP-La W诱导的31.44％和38.64％的凋亡率。在质粒转染后48h ，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表达产物诱导细胞凋亡率均超过50％， pEGFP-GM W 真核表达产物诱导细胞凋亡率达到了43.4％，而pEGFP-La V真核表达产物诱导细胞凋亡率最低，为33.44％。由此表明，来源于不同毒力 NDV毒株非结构蛋白V和W均能诱导早期细胞凋亡，但是诱导细胞凋亡能力存在一定的差异。

新城疫病毒V和W基因在DF-1细胞中的真核表达

采用2轮PCR扩增获得新城疫病毒疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因全长,分别克隆到pMD19-T载体上,然后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒经过酶切,PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,分别命名为pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W。将各重组质粒分别转染到DF-1细胞,于转染后12、24h和36h在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP在细胞中的表达情况。结果显示,各质粒转染DF-1细胞后在12h就可以见到绿色荧光蛋白,随着时间的延长,绿色荧光蛋白荧光强度增加,到36h后达到最强,而对照组始终没有见到GFP蛋白的表达,表明在转染的阳性细胞中融合蛋白pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W均能够有效的表达,该结果为新城疫病毒V和W基因的功能研究奠定了基础。

日照麻鸡ATPATP5A1W基因的克隆和生物信息学分析

ATP5A1W(ATP synthase subunit alpha)基因定位于鸟类W染色体上,其编码产物参与氧化磷酸化,在跨膜质子动力势的推动下合成ATP。本试验以日照麻鸡为试验材料,采用RT-PCR技术克隆ATP5A1W基因,结合生物信息学方法分析其生物学特征。结果表明,克隆得到日照麻鸡ATP5A1W基因c DNA长度为1 695 bp,开放阅读框1 662 bp,编码553个氨基酸。该核苷酸序列与Gen Bank(登录号:XM_429118)上预测的核苷酸序列一致性为100%。进化树分析表明,日照麻鸡ATP5A1W氨基酸序列与绿头鸭和鹅的进化关系较近。鸡ATP5A1W蛋白亚细胞定位于线粒体(78.3%)、细胞质(8.7%)、细胞核(8.7%)和细胞外(4.3%)。预测鸡ATP5A1W蛋白二级结构由42.86%的α-螺旋,19.89%的延伸链,10.49%的β-转角,26.76%的无规则卷曲组成。此研究结果将为开展日照麻鸡ATP5A1W基因的结构和功能提供参考。

W基因组织表达的特异性

Ｗ基因是利用周转神经髓鞘蛋白ＰＭＰ－２２基因的编码区５’－及３’－序列引物，藉ＰＣＲ方法自人脑胶质瘤ｃＤＮＡ文库中扩增的一个基因片段，本实验研究Ｗ基因组织表达的特性性。方法搜集不同组织来源的肿瘤及正常脑组织标本，行ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＮＡ斑点杂交检测。

鸡W染色体基因CTIF在鸡胚组织中的表达研究

该文对CTIF在胚胎发育过程中的表达进行初步研究。通过设计特异性扩增W拷贝、Z拷贝以及同时扩增W和Z拷贝的引物(CTIF-W、CTIF-Z及CTIF-ZW),对其在胚胎的不同日龄的组织的mRNA表达量进行分析,并通过FAD(fadrozole)诱导性反转探索其对性别表型的响应。结果显示,CTIF-W在孵化6 d的胚胎性腺中的表达高于尾部,且随胚胎发育表达量逐渐升高,而CTIF-Z和CTIF-ZW的表达趋势相似;而在6 d鸡胚的其他组织中,CTIF-ZW在肾中的表达显著高于其他组织,说明CTIF在发挥某些基础功能的同时可能还与肾脏的发育或功能相关。CTIF-Z在多数组织中表达量均呈现出雄性高于雌性,而CTIF-ZW在雌雄之间的表达量差异则相对较小,表明W拷贝可能在一定程度上调控了雌性中Z拷贝的表达。CTIF-W和CTIF-Z在12 d的胚胎组织中均表达,且均高度表达于脾脏组织中;CTIF-Z在大多数组织中雄性表达高于雌性。此外,CTIF-W表达受雌性向雄性性反转的影响而显著降低,而CTIF-Z则没有响应。综上,CTIF在鸡胚的肾脏和脾脏中高度表达,且其Z拷贝在雌雄组织之间存在剂量效应,而W拷贝可能在雌性中作为Z拷贝的补偿以保证其生物学功能的发挥。

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。

结核分枝杆菌北京／W基因家族研究进展

结核分枝杆菌是一个全球性的病原菌，全球约有1／3的人受到感染，同时每年造成将近300万例死亡。目前世界结核病流行主要是由几种特殊的结核分枝杆菌家族引起的，如北京／W基因家族、LAM家族、Haarlem家族、X族群以及其他未定名的菌株群。北京／W基因家族是结核分枝杆菌复合群中一个重要的分支，北京／W基因家族可引起医院、社区结核病的暴发，同时也与耐药及结核病的治疗失败和复燃有关，具有很强的致病力。因此近年来引起人们极大的关注。

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR(Q-PCR)检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%(P<0.0001)。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中,转导出生后1 d的DCM小鼠原代心肌细胞。Q-PCR检测结果表明,CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA敲低效率达到55%(P<0.01)。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,再将200μL约1×1012AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时。Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%(P<0.01)。对5月龄野生型(WT)、DCM(未注射病毒组)和AAV9+DCM(基因组编辑工具注射组)三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示:DCM小鼠的心血管形态异常,而AAV9+DCM小鼠心血管形态趋于正常。对3组小鼠的心脏进行超声心动图,并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数(left ventricular percent ejection fraction,LV EF%)、左心室短轴缩短率(left ventricular percent fractional shortening,LV FS%)分别下降50.4%(P<0.0001),55.1%(P<0.0001),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升66.5%(P<0.01),77.0%(P<0.01)。通过Q-PCR和天狼星红染色检测3组小鼠的心肌纤维化程度。结果显示,DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍(P<0.001)、4.5倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降2.0倍(P<0.05)、1.4倍(NS)。天狼星红染色结果显示,纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测3组小鼠的心肌心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平。结果表明,DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降2.8倍(P<0.05),Nppa蛋白表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变(gRNA 5T),以及正常的TNNT2 mRNA(gRNA 5V)序列分别组合转染到293T细胞中。通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%(P<0.0001),而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141WmRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。

鸡W染色体基因GPBP1在胚胎组织中的表达研究

鸡W染色体为进化过程中保留下来的Z染色体高度退化后的拷贝,在机体发育和代谢等过程中发挥着重要作用。以鸡W染色体上富含GC启动子的结合蛋白(GPBP1)基因为对象,对其在胚胎发育过程中的表达和功能进行初步研究;根据GPBP1基因在W和Z染色体上序列的不同,设计特异性引物扩增其W拷贝(GPBP1-W)、Z拷贝(GPBP1-Z)及同时扩增W和Z拷贝(GPBP1-ZW),采用qPCR及Western blot技术分析其在胚胎发育过程中不同组织的表达量,并通过FAD诱导性反转探究其对性别表型的响应。结果表明:GPBP1-W在孵化6 d的胚胎性腺中高表达,且表达量随胚胎发育而升高。GPBP1-W和GPBP1-Z在所检测的孵化12 d的胚胎组织中均有表达,其中mRNA高表达于脾脏组织中,蛋白高表达于性腺组织中;GPBP1-Z mRNA和蛋白质在雄性组织中的表达量高于雌性。GPBP1-W表达受雌性向雄性性反转的影响而显著降低,但GPBP1-Z的表达不受性反转的影响。这一研究提示,鸡性染色体基因GPBP1在鸡胚的性腺和脾脏中表达量高,且其Z拷贝在性别间和各组织中存在剂量效应和转录后调控作用,而W拷贝可能在雌性的部分组织中作为Z拷贝的补偿以保证其生物学功能的发挥。

肾上腺素β3受体基因W64R多态性与苯那普利疗效之间的关系

目的 探讨肾上腺素β3受体基因W6 4R多态性与原发性高血压患者苯那普利降压疗效之间是否存在相关性。方法 在安徽省安庆及霍邱地区人群中筛选原发性高血压患者 1170名 ,所有患者予苯那普利 10mg每日一次口服 15d ,测定其用药前后的血压 ,并进行肾上腺素 β3受体基因W6 4R基因型测定 ,观察其血压下降情况与基因型的关系。结果 (1)在中国南方汉族原发性高血压患者中 ,ADRβ3W6 4R多态性位点的基因型频率是 :WW基因型 72 .8%、WR基因型 2 5 .4 %、RR基因型 1.8%。 (2 )苯那普利 10mg每日一次口服 15d ,女性患者收缩压下降水平在ADRβ3W6 4R多态性位点各基因型之间差异具显著性 ,WR RR基因型者比WW基因型者收缩压下降少3.4 9mmHg(P =0 .0 3)。 (3)药物治疗 15d后女性患者第 16天收缩压降至 14 0mmHg以下、舒张压降至 90mmHg以下或下降幅度≥ 15 %的达标率 ,WR RR基因型低于WW基因型 (OR =0 .6 5 ,P <0 .0 5 )。结论 在女性原发性高血压患者肾上腺素 β3受体基因W6 4R多态性与原发性高血压患者苯那普利降压疗效之间存在相关性 ,可能为预测苯那普利降压疗效的一个预报因子 ,指导临床用药。

人参皂苷Rg1对过氧化氢诱导氧化应激下酵母的影响

为研究人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)对过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)诱导氧化应激下的酿酒酵母细胞的影响,文章采用绘制生长曲线评估Rg1和H2O2对酵母增殖生长的影响,检测Rg1和H2O2影响下酵母胞内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性;荧光定量PCR检测YML131W基因的差异化表达。研究发现在Rg1作用下酵母在生长稳定期的细胞活力、胞内SOD和CAT活性以及YML131W基因表达都显著性被上调,在H2O2氧化胁迫下,酵母生长受抑制,低浓度H2O2短时间内促进了SOD、CAT活性和YML131W基因表达;预先经Rg1处理的酵母在高浓度H2O2刺激下,仍能保持一定的细胞活力与胞内抗氧化酶活性。因此可以认为,人参皂苷Rg1具有提高酵母对氧化应激耐受性的作用,酵母YML131W基因是其发挥作用的潜在靶点。

W16转济麦19小麦株系抽穗期抗旱性研究

以两个转W16基因小麦株系及相应的受体对照品种为材料,在大田控水的条件下研究了水分胁迫对转基因小麦抽穗期相关生理特性的影响,利用方差分析方法对转基因株系的抗旱性进行了综合评价。结果表明:转基因株系和对照及受体有着较大的差异,随着水分胁迫的加剧,参试品种的相对含水量、气孔导度、光合速率、叶绿素含量呈下降趋势,转基因小麦的下降幅度较小;丙二醛含量、胞间CO2浓度、质膜相对透性呈上升趋势。受体对照品种的上升幅度大于转基因小麦;转基因小麦的脯氨酸含量显著高于对照品种。方差分析表明,转基因小麦株系G19-X51、G19-X61具有较好的抗旱性。

OsBELL4A调控水稻WOX家族基因表达及水稻幼苗生长和耐逆

根系不仅对地上部分起着重要的支撑作用,也是植物吸收水分和养分的主要器官。为了研究BELL家族因子在植物生长发育及逆境胁迫应答中的功能,通过与拟南芥序列对比,鉴定到水稻4个BS同源基因,它们的启动子含有ABRE、GARE、ERE、ARE和DRE等应答逆境胁迫和激素信号的元件。在水稻根中进行实时定量PCR分析表明,这4个BELL4同源基因不仅受到干旱、低温以及盐等逆境胁迫诱导,而且还受到植物激素乙烯、赤霉素以及脱落酸的调控,表明这些基因可能应答多种激素及逆境胁迫。进一步分析OsBELL4A干扰材料表型发现,抑制OsBELIAA基因能够促进W0X家族基因的表达水平,并抑制水稻苗期初生根生长,但使冠根数量增多。这些结果表明水稻BELL4同源基因0sBELL4A在水稻根系发育及逆境胁迫应答中可能具有重要的调控功能。