PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域。方法采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用。结果酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1(WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用。结论RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于、、三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位。

p62体募集自噬相关蛋白WIPI2的机制研究

目的探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)复合物的结合蛋白WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系。方法使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)中的自噬相关基因2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62基因,建立Atg2A和Atg2B基因敲除的细胞系(Atg2AB double knockout,Atg2AB DKO)以及p62基因敲除细胞系(p62 knockout,p62 KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位;活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与自噬相关蛋白WIPI2的定位变化;光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复;通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系;通过蛋白免疫印记检测WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化。结果建立了Atg2AB DKO和p62 KO细胞系;透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡;在Atg2AB DKO中,通过活细胞成像观察到tdTomatop62与WIPI2-GFP高度共定位;荧光漂白实验观察到WIPI2具有流动性;通过免疫荧光观察到,与WT细胞相比,在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P<0.0001);与WT细胞相比,p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P>0.05)。结论无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合,促进自噬体的形成。

ANKIB1相关泛素结合酶的筛选

含锚蛋白重复和IBR结构域蛋白1(ankyrin repeat and IBR domain-containing protein 1,ANKIB1)属于RING-IBR-RING(RBR)蛋白家族,也是该家族中唯一含有泛素结合模体的成员,能促进某些蛋白的泛素化.几乎所有的RBR蛋白都具有泛素连接酶(E3)活性.ANKIB1也被推测为一种E3,但迄今尚未证实.RBR型E3能够与多种泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,Ubc,统称E2)互作并发挥催化作用,其中最常见的是UbcH7,UbcH8和UbcH5B次之.为了筛选ANKIB1相关的E2,本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了UbcH5B、UbcH7和UbcH8蛋白,并采用GST沉降(GST pull-down)实验验证3种E2与ANKIB1的相互作用.实验结果表明,内源性及过表达的ANKIB1均能与UbcH5B、UbcH7或UbcH8相互作用,同时ANKIB1也是唯一能与这3种E2互作的RBR蛋白.本研究为ANKIB1可能是1种E3的假说提供了支持,并为后续研究ANKIB1的E3活性和催化机制提供了线索.

扶正抗癌方联合吉非替尼对A549细胞的协同抗癌作用及机制

目的:通过体外体内实验观察扶正抗癌(FZKA)方联合吉非替尼(Gefitinib)对人肺腺癌A549细胞增殖,凋亡及侵袭转移能力的影响,并探讨研究其相关作用机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测空白组,FZKA方组(0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 g·L^-1),Gefitinib组(10,20,40,60,80,100μmol·L^-1)的干预A549细胞24,48,72 h及FZKA方(2 g·L^-1)联合Gefitinib(40μmol·L^-1)组干预A549细胞24 h的增殖能力;流式细胞术分析检测联合用药组细胞凋亡及周期的变化;划痕实验和transwell小室实验检测联合用药组的侵袭转移能力变化;蛋白免疫印迹法检测细胞联合用药组活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax),F-盒和含蛋白7的WD重复结构域(FBW7)及髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白表达的变化情况。结果:与空白组比较,FZKA方,Gefitinib呈剂量依赖性、时间依赖性显著抑制A549细胞的增殖(P<0.05);与空白组比较,FZKA方组,Gefitinib组均能减弱细胞划痕愈合能力和侵袭能力,促进细胞凋亡(P<0.05),均能上调Bax,Caspase-3,FBW7蛋白表达,下调Bcl-2,MCL-1蛋白表达(P<0.05);与Gefitinib单独给药比较,FZKA方联合Gefitinib抑制A549细胞增殖能力和诱导细胞凋亡更明显(P<0.05);细胞划痕愈合能力与侵袭能力明显减弱(P<0.05);上调Bax,Caspase-3,FBW7蛋白表达,下调Bcl-2,MCL-1蛋白表达效果明显(P<0.05)。结论:FZKA方与Gefitinib合用后比单用Gefitinib更能诱导A549细胞凋亡,抑制其增殖及侵袭转移能力更强,两者具有协同抗癌作用,其机制可能与调控FBW7/MCL-1通路相关。

形态学检测在自噬研究中的应用

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞过程。自噬可分为三个相对独立的步骤:自噬泡起始形成阶段、自噬小体形成阶段以及成熟降解阶段,每个阶段都有其相对独特的形态学特征或分子标志物变化。本文综述了自噬研究中常用的形态学研究方法、结果阐释及这些过程中的关键注意事项。